2、結(jié)果
2.1紫外誘變劑量的確定(見圖1、圖2)
圖1 P2紫外誘變孢子致死率
圖2 P2紫外誘變30 s萌發(fā)菌株
如圖1、圖2所示，隨著照射時間的延長，孢子的萌發(fā)數(shù)降低，在0～30 s內(nèi)致死率快速升高，在處理30 s時致死率達78.07%，30 s后上升緩慢，確定以30 s為最佳誘變劑量。
2.2誘變菌株初選
以30 s為誘變劑量，連續(xù)誘變10批，挑出萌發(fā)菌株194株，其中26株為正突變，正突變率為13.4%，結(jié)合親本對峙試驗（見圖3）和初篩平板培養(yǎng)基篩選試驗（見表2），篩選出直徑較大的5株優(yōu)良誘變菌株，分別為16、18、20、89、102號，其變色圈為出發(fā)菌變色圈直徑的1.5倍以上。
圖3誘變菌株與親本對峙試驗
表2誘變菌種愈創(chuàng)木酚變色圈直徑（cm）
2.3誘變菌株復選
2.3.1生長速度
誘變菌株的菌絲生長情況見表3。如表3所示，各誘變菌株生長速度均顯著快于出發(fā)菌，各個菌株生長速度89＞20＞102＞18＞16＞對照組，其中89、20、102、18號誘變菌株的生長速度極顯著地高于對照組(P＜0.01)，而16號誘變菌株生長速度顯著高于對照組(P＜0.05)。
表3誘變菌株的菌絲生長情況（mm/d）
2.3.2酶活性（見表4）
表4誘變菌株胞外酶活性（U/ml）
如表4所示，與出發(fā)菌株對照組相比，誘變菌株木質(zhì)素過氧化酶（LiP）和漆酶（Lac）活性均不同程度地高于對照組，纖維素酶差異不顯著，其中誘變菌株89的酶活性最高，極顯著高于對照組（P＜0.01），誘變菌株89、20和102號的LiP酶活性分別為對照組2.03、1.69倍和1.60倍，誘變菌株89、102、18號的Lac酶活性分別為對照組1.89、1.79倍和1.76倍。
2.3.3纖維成分變化（見表5）
表5誘變菌株處理秸稈纖維成分變化（%）
如表5所示，各誘變菌株均不同程度降低了部分纖維成分的含量。其中89號菌株纖維含量降低程度最大，20號菌株次之。與對照相比，89號和20號菌株NDF含量分別降低5.28%和3.77%，達到極顯著水平（P＜0.01）。二者的ADF含量分別降低5.16%（P＜0.01）和4.58%（P＜0.05）。而木質(zhì)素含量分別降低了19.89%（P＜0.05）和15.37%（P＞0.05）。按木質(zhì)素降解率計算，89號菌株木質(zhì)素降解率較對照組提高了51.76%。
3、討論
3.1紫外誘變及初篩
紫外誘變處理側(cè)耳菌，方法簡便，是真菌最常用的育種方法之一。研究表明，適當劑量的紫外線處理能引起DNA的斷裂和交聯(lián)，核酸和蛋白質(zhì)的交聯(lián)，胞嘧啶和尿嘧啶的水合作用，形成胸腺嘧啶二聚體。紫外誘變時誘變劑的劑量與燈的功率、照射時間和燈與微生物的距離相關。在本試驗中，采用紫外燈照射30 s，照射孢子懸浮液濃度為1×108個/ml左右，致死率為70%～80%。試驗結(jié)果表明，誘變時間越長，正突變越高，同時負突變率也較高。因此，30 s的紫外照射進行誘變處理有利于提高正誘變率。根據(jù)出發(fā)菌的生長特性，本研究采用孢子進行誘變，可避免菌落不純的現(xiàn)象。能在以愈創(chuàng)木酚為指示劑的培養(yǎng)基上產(chǎn)生變色圈表明微生物具有木質(zhì)素降解能力，且變色圈的大小深淺與產(chǎn)酶能力有關。本試驗采用了以愈創(chuàng)木酚為唯一碳源的方式，進行木質(zhì)素降解能力的篩選，誘變菌株和出發(fā)菌有明顯的拮抗帶，表明誘變后為新菌株，且愈創(chuàng)木酚培養(yǎng)基的變色圈明顯增大，表明誘變菌株木質(zhì)素降解酶代謝能力提高。
3.2酶活性及纖維降解能力
本試驗結(jié)果表明，通過紫外誘變獲得一枚菌株89號，其LiP和Lac活性分別為出發(fā)菌的2.03倍和1.89倍，菌絲生長速度提高18.21%，LiP、Lac酶活性高峰出現(xiàn)在處理秸稈的第15～20 d。本試驗中纖維素酶活性高峰出現(xiàn)的相對滯后，這正是處理秸稈作為飼料所希望的，分解木質(zhì)素，而保留纖維素作為家畜的營養(yǎng)。采用射線處理白腐真菌，其中處理效果好的菌株其LiP及Lac活性提高1.4～2倍，而且酶活高峰出現(xiàn)在12～18 d，這與本試驗結(jié)果接近。對白腐真菌F4孢子懸液進行紫外和N+離子注入誘變，獲得菌株漆酶活性是出發(fā)菌株的16倍。對刺芹側(cè)耳（Pleurotus eryngiiGIM 5.280）的原生質(zhì)體進行紫外和60Coγ雙重誘變，獲得一株漆酶的高產(chǎn)菌株，與出發(fā)菌相比酶活表達量提高54.3%。這些試驗結(jié)果均表明紫外誘變可以導致菌株產(chǎn)生分解木質(zhì)素的酶活性顯著提高。由秸稈粉木質(zhì)降解程度可知，木質(zhì)素降解能力與木質(zhì)素過氧化酶（LiP）及漆酶（Lac）酶活性密切相關。研究表明，LiP催化氧化β-1非酚型木質(zhì)素模型化合物為其芳香正離子自由基，使木質(zhì)素斷裂形成3,4-二甲氧基苯乙醇自由基和質(zhì)子化形式的藜蘆醛，并進一步將醛氧化成酸，再經(jīng)過LiP對低分子木質(zhì)素和單環(huán)芳香化合物的開環(huán)作用，獲得的低分子產(chǎn)物可被微生物降解。
用紫外線照射糙皮側(cè)耳的原生質(zhì)體篩選高效分解秸稈的菌株，采用該菌株處理秸稈其木質(zhì)素和纖維素的降解率分別為出發(fā)菌株的1.75倍和1.71倍。采用射線照射白腐真菌處理秸稈，在發(fā)酵20～30 d時，出發(fā)菌株與誘變菌株發(fā)酵秸稈，其酸不溶木質(zhì)素（ADL）的降解明顯提高；在發(fā)酵的第30 d，其中的3個誘變菌株處理秸稈使ADL的降解率提高0.88～1.23倍。采用He-Ne激光對白腐真菌L1原生質(zhì)體進行誘變，選育出一菌株Lx，其木質(zhì)素降解率比出發(fā)菌株提高50%。本試驗結(jié)果表明，誘變菌株89號處理秸稈后其木質(zhì)素含量降低了19.89%，NDF和ADF含量分別降低5.28%和5.16%，木質(zhì)素降解率較對照組提高了51.76%。其它4株誘變菌株的木質(zhì)素、NDF和ADF含量變化較小。本結(jié)果還表明，不同菌株處理的秸稈纖維含量大小與酶活性高低變化相對應。秸稈的細胞壁結(jié)構主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素構成，而木質(zhì)素與半纖維素以其堅固的酯鍵相結(jié)合，并將纖維素包裹在其中。木質(zhì)素的分解意味著堅固的細胞壁結(jié)構被破壞，這樣就可以釋放動物可以消化利用的纖維素，提高秸稈營養(yǎng)物質(zhì)的消化利用率。以上研究結(jié)果表明，在秸稈發(fā)酵的15～20 d，木質(zhì)素分解酶的活性遠高于纖維素酶活性，木質(zhì)素的降解率也大于纖維素的分解率（由表1及表5計算可知），這有利于降解木質(zhì)素而保留纖維素的秸稈處理模式。
4、結(jié)論
通過紫外誘變育種和篩選試驗，綜合生長速度、產(chǎn)酶活性及木質(zhì)素降解能力得到的P89誘變菌株，木質(zhì)素過氧化酶和漆酶活性分別為出發(fā)菌的2.03倍和1.89倍，菌絲生長速度提高18.21%，木質(zhì)素含量降低19.89%。菌株P89為本研究誘變篩選獲得的開發(fā)秸稈資源優(yōu)秀菌株。
紫外誘變處理側(cè)耳菌，篩選獲得的開發(fā)秸稈資源優(yōu)秀菌株（一）
紫外誘變處理側(cè)耳菌，篩選獲得的開發(fā)秸稈資源優(yōu)秀菌株（二）
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