深海（水深超過1000米）生物圈是地球上最大的生態(tài)系統(tǒng)之一，孕育著多種生命形式。估計那里存在超過1029個微生物細胞。此外，每天伴隨著海雪、鯨落和洋流，大量微生物從表層海水被動遷移到深海水中。這些微生物的遷移伴隨著壓力的增加和溫度的降低。深海具有高壓、低溫、黑暗等極端環(huán)境特性，曾被認為是生命的禁區(qū)，但近些年發(fā)現(xiàn)深海生存著大量的微生物資源，形成了獨特的深海生態(tài)系統(tǒng)。高靜水壓力（HHP）對微生物細胞的許多生理活動有很大的抑制作用，例如膜流動性、RNA合成、運動性、營養(yǎng)吸收、細胞分裂、蛋白質(zhì)合成和復(fù)制。生活在深海的微生物類群必須能夠耐受深海高靜水壓。到目前為止，雖然已經(jīng)揭示了深海微生物適應(yīng)高壓環(huán)境的一些策略，例如增加細胞膜的流動性，調(diào)整細胞代謝途徑等，但是至今沒有發(fā)現(xiàn)和鑒定出深海微生物耐壓相關(guān)的功能基因和代謝機制。
三甲胺(TMA)和三甲胺N-氧化物(TMAO)是廣泛分布在海洋中的含氮有機化合物。描述了TMAO在海洋微生物中的兩個功能。TMAO被α-變形菌的SAR11進化枝和海洋玫瑰桿菌進化枝用作氮源。Myroides profundi D25 T是擬桿菌門的成員，從沖繩海槽南部的深海沉積物（水深1245米）中分離出來。研究發(fā)現(xiàn)菌株D25是一種耐壓細菌，它使用TMAO作為壓電電解質(zhì)來應(yīng)對HHP應(yīng)激。菌株D25通過TMA轉(zhuǎn)運蛋白TmaT吸收TMA，然后使用TMA單加氧酶(Mp Tmm)將TMA氧化成TMAO。由此產(chǎn)生的細胞內(nèi)TMAO的積累能夠在高壓下生長。本研究揭示了TMA/TMAO在海洋細菌中的新功能，并提供了獨特的代謝途徑與深海細菌中HHP適應(yīng)之間的直接聯(lián)系。
芬蘭Bioscreen全自動生長曲線分析儀的應(yīng)用
使用含有3%(m/v)人造海鹽、維生素復(fù)合物、1 mM TMA或TMAO、10 mM葡萄糖、0.2 mM Na3PO4、10 mM Hepes和5μM FeCl3(36)的確定培養(yǎng)基測試菌株D25和DSS-3是否可以使用TMA或TMAO作為氮源。使用自動生長曲線分析儀（Bioscreen）記錄在25°C培養(yǎng)的兩種菌株的生長情況。
實驗結(jié)果：TMAO是一種蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑，可以抵消HHP對海洋動物的影響。研究發(fā)現(xiàn)菌株D25是一種耐壓細菌，它使用TMAO作為壓電電解質(zhì)來應(yīng)對HHP應(yīng)激。菌株D25通過TMA轉(zhuǎn)運蛋白TmaT吸收TMA，然后使用TMA單加氧酶(Mp Tmm)將TMA氧化成TMAO。由此產(chǎn)生的細胞內(nèi)TMAO的積累能夠在高壓下生長。TMA的存在還改善了擬桿菌門中其他細菌的生長，這些細菌在HHP下含有編碼TmaT和Mp Tmm同源物的基因，表明這可能是深海擬桿菌門采用的常見策略。揭示了TMA/TMAO在海洋細菌中的新功能，并提供了獨特的代謝途徑與深海細菌中HHP適應(yīng)之間的直接聯(lián)系。
圖1、(A)以TMA或TMAO為唯一氮源培養(yǎng)的菌株D25和DSS-3的生長曲線。(B)D25菌株在初始TMA濃度為85μM的2216E培養(yǎng)基中培養(yǎng)的TMA和胞內(nèi)TMA和TMAO濃度的變化。(C)應(yīng)變D25菌株在4°C下在0.1、20和40 MPa下添加或不添加10μM TMA的生長曲線。(D)10μM TMAO或TMA對菌株D25在不同壓力下生長和存活的影響。孵育開始（開始）時的細胞數(shù)約為1×10 6CFU/毫升。將培養(yǎng)物在4°C下培養(yǎng)10天，然后計算CFU并與起始培養(yǎng)物的CFU進行比較。紅線是指培養(yǎng)物中細胞的完全死亡對照。在沒有TMAO或TMA的情況下培養(yǎng)的菌株D25。(E)D25菌株在不同壓力下添加或不添加10μM TMA的形態(tài)學(xué)觀察。
圖2、(A)重組Mp Tmm在4°和25°C下氧化TMA的非線性擬合曲線。(B)不同濃度TMA對D25菌株Mptmm基因表達的影響。菌株D25在有或沒有TMA的2216E培養(yǎng)基中培養(yǎng)1小時。(C)靜水壓力對D25菌株Mptmm基因表達的影響。菌株D25在2216E培養(yǎng)基中在大氣壓、20或40 MPa下培養(yǎng)1小時。(D)Mp Tmm和Rn Tmm的結(jié)構(gòu)比較。Mp Tmm為黃色，Rn Tmm為紫色。(E)Mp Tmm和Rn Tmm晶體結(jié)構(gòu)中NADP+(左)和FAD(右)位置的比較。FAD和NADP+分子顯示為Mp Tmm為黃色和Rn Tmm為紫色的棒。(F)溫度對Mp Tmm活性的影響。(G)DSC測量Mp Tmm的T m值。(H)分別在25°和4°C測量不同壓力下的酶活性。
圖3、TmaT的表征。(A)實時定量PCR檢測靜水壓力對菌株D25基因tmaT表達的影響。菌株D25在2216E培養(yǎng)基中在大氣壓、20或40 MPa下培養(yǎng)1小時。誤差條代表來自三次實驗的SD。（B到E）將TMA或TMAO滴定為TmaT的ITC曲線。顯示了ITC跡線（頂部）和綜合結(jié)合等溫線（底部）。滴定底物和溫度如圖所示。(F)TmaT及其與其他BCCT轉(zhuǎn)運蛋白的同源物的分子系統(tǒng)發(fā)育分析。序列來自IMG/JGI數(shù)據(jù)庫。BetP、BetT和CaiT分別是甘氨酸甜菜堿、膽堿和肉堿的BCCT轉(zhuǎn)運蛋白。
圖4、TMA等季胺對菌株D25在高溫高壓下生長的影響。a）不同濃度的TMA對菌株D25在20 MPa下生長的影響。培養(yǎng)基由3%人工海鹽、0.05%蛋白胨、0.01%酵母粉和不同濃度的TMA組成。培養(yǎng)物在25℃下培養(yǎng)2天。b）不同壓力下季胺對菌株D25生長的影響。培養(yǎng)基中添加3%人工海鹽、0.05%蛋白胨、0.01%酵母粉和20μM季胺。培養(yǎng)物在25℃下培養(yǎng)2天。控制，不含季胺。誤差條表示三次重復(fù)實驗的標準差。
圖5、TmaT和Mp Tmm在重組大腸桿菌DH5α、大腸桿菌突變體Δtor CAD和枯草芽孢桿菌168中的體內(nèi)功能。(A,C,和D)TmaT和Mp Tmm的表達對大腸桿菌DH5α(A)、Δtor CAD(C)和B.subtilis 168(D)在不同壓力下48小時培養(yǎng)的生長和存活的影響。孵育開始（開始）時的細胞數(shù)約為1×105 CFU/毫升。將菌株在25°C下培養(yǎng)48小時，加入或不加入20μM TMA，然后計數(shù)CFU并與起始培養(yǎng)物（結(jié)束/開始）進行比較。(B)Δtor CAD共表達TmaT和Mp Tmm的細胞在25°C不同壓力下加或不加20μM TMA培養(yǎng)48小時的形態(tài)學(xué)觀察。
總結(jié)：本研究以深海細菌Myroides profundi D25為研究對象，發(fā)現(xiàn)該菌株能夠利用三甲胺（TMA）轉(zhuǎn)運載體TmaT吸收深海環(huán)境中的TMA，在細菌胞內(nèi)誘導(dǎo)表達三甲胺單加氧酶MpTmm，將TMA氧化為氧化三甲胺（TMAO），并在胞內(nèi)累積。在深海高壓下，TMAO能夠保護蛋白質(zhì)等生物大分子，使其維持正常的構(gòu)象，發(fā)揮生物學(xué)功能，從而使得D25菌株具有耐受深海高靜水壓的能力，維持生存和生長。將TmaT-MpTmm蛋白在大腸桿菌和枯草桿菌菌株中表達，可顯著提高大腸桿菌和枯草桿菌菌株的耐壓能力。生物信息學(xué)分析表明TmaT和MpTmm同源蛋白在海洋細菌，尤其是擬桿菌門細菌中廣泛分布，表明這可能是深海細菌普遍采用一種耐壓策略，具有重要理論意義。