大蠟螟感染模型
通過用10^7個酵母細胞攻擊幼蟲進行大蠟螟幼蟲的體內(nèi)實驗。與對照組相比，接種酵母的幼蟲出現(xiàn)色素沉著增強（圖4A）。獲得了3個獨立實驗的生存曲線。與對照組相比，所有分離株都降低了幼蟲的存活率，但注射分離株5的幼蟲存活率降低始終顯著高于其他組。圖4B顯示了3個實驗合并數(shù)據(jù)的生存曲線，其中分離株5的中位生存期為7天，而其他分離株為9-11天。未感染對照組的中位生存期為14天。我們還用10^4和10^6個酵母進行了實驗，但在這些接種量下，幼蟲的存活率與未感染對照組相似（數(shù)據(jù)未顯示）。
感染后第3天和第6天，真菌負荷沒有顯著差異。感染后第6天獲得的CFU范圍從分離株4的1.4 x 10^7到分離株1的8.2 x 10^7。
推定毒力因子
由于我們發(fā)現(xiàn)分離株5在大蠟螟中的毒力與其他分離株不同，我們評估了與毒力相關的因素是否可以解釋這種變化的原因。所有5株分離株在37°C的Christensen尿素肉湯中培養(yǎng)4天和7天后脲酶產(chǎn)生均為陽性，在559 nm處的平均吸光度沒有差異。通過測量瓊脂上azoalbumin降解暈圈確定的蛋白酶活性范圍在0.6到0.76之間，分離株1的活性最高（p/z=0.6）。該活性與分離株2和分離株4有顯著差異。通過DHN-黑色素干重/酵母干重比值獲得的分離株產(chǎn)生的DHN-黑色素比例沒有統(tǒng)計學差異。所有分離株在35°C和37°C下生長，在39°C下均不生長。此外，分離株在BHI培養(yǎng)基中的生長曲線相似，它們之間沒有統(tǒng)計學差異（圖5）。
關于對氧衍生物種的敏感性，分離株2在暴露4小時時生長抑制最高，與分離株3和分離株4有顯著差異（圖6A）。其他時間點的差異不顯著。暴露于活性氮中間體降低了分離株的存活率，但分離株5的存活率在所有檢查時間點始終高于其他分離株。然而，這些差異并不顯著（圖6B）。
藥敏試驗
所有分離株對抗真菌藥物的敏感性相似，特比萘芬的MIC為0.06μg/mL，伊曲康唑為1.0μg/mL，酮康唑和兩性霉素B為2.0μg/mL，伏立康唑為≥8.0μg/mL。
討論
我們的研究重點在于表征該患者體內(nèi)連續(xù)分離的分離株，因為他在11年期間患有孢子絲菌病，具有臨床侵襲性和治療困難，并播散到皮膚和骨骼。我們必須指出，由于農(nóng)村地區(qū)距離醫(yī)療診所較遠、即使像碘化鉀這樣廉價的藥物也費用高昂以及不愿接觸醫(yī)療系統(tǒng)等原因，在某些巴西人群中，缺乏前期治療的情況不幸地很常見。盡管患有糖尿病和高血壓，該患者先前是健康的，這表現(xiàn)在他能夠在砌磚工這種體力壓力大的條件下積極工作，并且為尋找可能的潛在免疫抑制狀況而進行的測試未顯示異常。初始T細胞的減少可能與慢性感染引起的淋巴細胞持續(xù)刺激，誘導其分化有關。
考慮到該患者疾病的慢性和復發(fā)性，我們考慮了以下可能性：1)他可能被不同物種或菌株再感染，或2)感染菌株的毒力隨時間發(fā)生了變化。然而，我們確認每個分離株都是巴西利亞孢子絲菌。雖然不具決定性，但分離株在指紋圖譜PCR中的條帶模式?jīng)]有差異（圖2）表明它們是相同的；然而，這并不能排除隨著時間的推移被同一菌株再感染，而不是慢性疾病的復發(fā)。
分離株5的幾丁質(zhì)合成酶編碼基因中的多態(tài)性表明幾丁質(zhì)合成酶基因發(fā)生了改變，這可能通過影響幾丁質(zhì)合成和細胞壁結(jié)構(gòu)來增加毒力。幾丁質(zhì)是真菌細胞壁和隔膜的重要組成部分，存在于所有已知的致病真菌中，但不存在于人類中。毒力決定因素包括宿主識別和入侵所需因子以及保護宿主防御系統(tǒng)的因子。由于細胞壁參與這些過程，它保護真菌細胞免受外部損傷，調(diào)節(jié)宿主細胞對細胞壁成分的粘附，并因此介導免疫反應。因此，細胞壁結(jié)構(gòu)及其組成的任何變化都可能影響真菌毒力。迄今為止，幾丁質(zhì)已與其他真菌（如巴西副球孢子菌、莢膜組織胞漿菌和皮炎芽生菌）的毒力相關。幾丁質(zhì)沉積可能影響黑色素化，這是病原性真菌（包括孢子絲菌）中與細胞壁和毒力相關的另一個重要因素。因此，幾丁質(zhì)的改變可能導致毒力的改變。
我們的體外巨噬細胞實驗未顯示患者分離株之間的毒力差異：巨噬細胞有效地吞噬了酵母，但一旦攝入后無法殺死它們。然而，我們使用大蠟螟幼蟲的體內(nèi)實驗一致地顯示，接種分離株5（在INI隨訪5年后獲得，即疾病總病程11年后）的幼蟲死亡率顯著更高，這強烈表明該分離株的毒力發(fā)生了變化。應該指出的是，大蠟螟模型已成功用于其他真菌和細菌，本研究是其在巴西利亞孢子絲菌中的首次使用。大蠟螟模型與嚙齒動物系統(tǒng)相比具有優(yōu)勢，例如成本低、易于儲存和處理以及更有利的倫理方面。
測定脲酶和DHN-黑色素以及我們對耐熱性的評估顯示分離株之間沒有差異。蛋白酶活性不一致，但分離株1測得的較高活性與所有其他分離株相比并不一致，并且似乎并未導致該分離株毒力增加，毒力實驗證明了這一點。所有分離株的抗真菌藥物敏感性相似。將我們患者菌株中發(fā)現(xiàn)的MIC與先前發(fā)表的里約熱內(nèi)盧孢子絲菌屬和巴西利亞孢子絲菌的藥敏譜進行比較，特比萘芬對分離株產(chǎn)生了最佳的體外療效，而唑類和兩性霉素B分別具有較差和中等的MIC結(jié)果。值得注意的是，盡管特比萘芬的MIC較低，但該藥物在幾年治療該患者的過程中僅取得中等成功。
最后，評估對氧化應激敏感性的測試顯示，分離株對活性氮中間體的敏感性高于對氧衍生物種。值得注意的是，分離株5對活性氮中間體的抵抗力最強。抵抗類似于巨噬細胞內(nèi)溶酶體中存在的不利條件的能力可能解釋了該分離株毒力較高的原因；然而，我們的結(jié)果不能完全得出這一結(jié)論。盡管如此，這一發(fā)現(xiàn)可能部分促進了該分離株的較高毒力。
由于患者自發(fā)病以來已退休，遠離他可能獲得感染的環(huán)境，我們的數(shù)據(jù)表明，合理地得出結(jié)論他一直是慢性感染。此外，將這些患者分離株鑒定為巴西利亞孢子絲菌有些令人驚訝，因為我們沒有發(fā)現(xiàn)與貓接觸的流行病學聯(lián)系，并且患者居住在里約熱內(nèi)盧孢子絲菌病"帶狀"區(qū)域之外的直轄市。
我們的數(shù)據(jù)支持這樣的結(jié)論：該患者在11年期間感染了相同的真菌。盡管其對特比萘芬體外敏感，但巴西利亞孢子絲菌菌株通過逃避他的免疫系統(tǒng)反應有效地留在了患者體內(nèi)。此外，大蠟螟研究表明，在該患者的疾病過程中毒力發(fā)生了演變。我們懷疑寄生蟲-宿主關系中存在其他未在此研究的方面，促成了這種毒力增加，需要進一步研究來闡明這些因素。我們認為這項體內(nèi)和體外研究是獨特的，因為它證明了巴西利亞孢子絲菌在患有慢性和播散性孢子絲菌病的宿主體內(nèi)毒力的演變。
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