2結(jié)果與討論
2.1菌株的分離及活性篩選
本實(shí)驗(yàn)以N－乙?；琢虬彼嶙鳛榉蛛x培養(yǎng)基中的唯一碳氮源。從來自氨基酸類化工廠附近的8份土樣中，分離了約500株菌，并對(duì)其進(jìn)行了D－氨基酰化酶活力的初篩與復(fù)篩，得到了酶活力及穩(wěn)定性均較好的菌株A55，酶活力達(dá)到70U，并對(duì)其進(jìn)行后續(xù)研究。
2.2菌株A55的鑒定結(jié)果
2.2.1形態(tài)學(xué)特征及生理生化特征（表1）
表1菌株A55的生理生化特征
菌株A55在LB固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)迅速，菌落圓形呈淡黃色，表面濕潤(rùn)，中心凸起，邊緣整齊；在分離固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)相對(duì)緩慢，菌落點(diǎn)狀呈乳白色，表面濕潤(rùn)，邊緣整齊。革蘭氏染色陽性，桿狀，鏈狀排列。
2.2.2 16SrDNA序列分析
PCR擴(kuò)增得到的菌株A55的16SrDNA序列全長(zhǎng)為1 416bp，將該序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中細(xì)菌及古菌的16SrDNA序列進(jìn)行Blast分析。結(jié)果表明，菌株A55與耐寒短桿菌相似度最高，達(dá)到100%，通過Mega5.2軟件得到了以16SrDNA序列為基礎(chǔ)的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）。
由圖1可知，菌株A55與耐寒短桿菌Brevibacterium frigoritolerans處于同一分支，親緣關(guān)系最近，結(jié)合形態(tài)學(xué)及生理生化特征可以確定菌株A55為耐寒短桿菌。
2.3菌株A55發(fā)酵條件的優(yōu)化
2.3.1培養(yǎng)條件的確定
圖1菌株A55的系統(tǒng)發(fā)育樹
溫度及培養(yǎng)基pH值對(duì)微生物的生長(zhǎng)有著非常重要的影響，搖床轉(zhuǎn)速及搖瓶裝樣量主要影響微生物的供氧，也是發(fā)酵中不可忽視的因素?？疾炝伺囵B(yǎng)溫度、培養(yǎng)基初始pH值、搖床轉(zhuǎn)速、裝樣量對(duì)菌株A55生長(zhǎng)及酶活力的影響，結(jié)果見圖2。
圖2培養(yǎng)溫度（a）、培養(yǎng)基初始pH值（b）、搖床轉(zhuǎn)速（c）及裝樣量（d）對(duì)菌株A55生長(zhǎng)及酶活力的影響
由圖2可知：菌株A55的最佳培養(yǎng)溫度為30℃，在此溫度下，菌體的生長(zhǎng)情況及酶活力均較好；菌株A55在初始pH值為5的培養(yǎng)基上無法生長(zhǎng)，其最適初始pH值為7；菌株A55發(fā)酵的最佳搖瓶轉(zhuǎn)速為200 r·min－1，最佳裝樣量為15%，這與菌株A55嚴(yán)格好氧密切相關(guān)。因此，確定菌株A55適宜的培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度30℃，培養(yǎng)基初始pH值7，搖瓶轉(zhuǎn)速200r·min－1，搖瓶裝樣量15%。在此條件下繼續(xù)考察其它因素的影響。
2.3.2菌齡對(duì)菌株生長(zhǎng)及酶活力的影響
菌株A55所產(chǎn)的D－氨基?；笇儆谡T導(dǎo)酶，只有在培養(yǎng)基中添加N－乙?；被嶙鳛檎T導(dǎo)物時(shí)，菌株才能合成D－氨基?；?。菌株A55的生長(zhǎng)曲線及菌齡對(duì)酶活力的影響見圖3。
圖3菌株A55的生長(zhǎng)曲線（a）及菌齡對(duì)酶活力的影響（b）
由圖3a可知，由于種子培養(yǎng)基與發(fā)酵培養(yǎng)基相同，菌株A55調(diào)整期非常短暫，很快進(jìn)入對(duì)數(shù)期，在第8h即進(jìn)入穩(wěn)定期。由圖3b可知，菌株A55在36～60h之間D－氨基酰化酶活力較高，第72h活力明顯降低，可以判斷菌株A55從第60h開始進(jìn)入衰亡期。因此，確定菌株的最佳培養(yǎng)時(shí)間為48h，酶活力達(dá)到82.99U。
2.3.3碳、氮源對(duì)菌株生長(zhǎng)及酶活力的影響
分別添加1%的葡萄糖、蔗糖、淀粉、甘油，0.5%的硝酸鈉、硫酸銨、尿素、蛋白胨，以發(fā)酵培養(yǎng)基為對(duì)照，考察不同碳、氮源對(duì)菌株A55的生長(zhǎng)及酶活力的影響，結(jié)果見圖4。
圖4碳源（a）和氮源（b）對(duì)菌株A55生長(zhǎng)及酶活力的影響
由圖4a可知，在培養(yǎng)基中分別添加不同碳源后，菌株A55的菌體量均明顯增加，葡萄糖的影響尤其突出，菌體量增加至對(duì)照的2.08倍；然而D－氨基?；富盍黠@降低。由圖4b可知，硝酸鈉、硫酸銨及尿素等無機(jī)氮源對(duì)菌株A55的菌體量影響不大，D－氨基酰化酶活力有所降低；相比之下，蛋白胨的添加使菌株A55的菌體量增加至對(duì)照的2.78倍，同時(shí)蛋白胨對(duì)D－氨基?；富盍τ绊懸草^大，使其降低至對(duì)照的24.67%。表明，培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)豐富反而抑制D－氨基?；傅暮铣?，這與該酶屬于誘導(dǎo)酶密切相關(guān)。
3結(jié)論
從氨基酸類化工廠附近土樣中分離出產(chǎn)D－氨基?；傅木闍55，通過形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特征測(cè)定及16SrDNA系統(tǒng)發(fā)育分析，鑒定其為短桿菌屬的耐寒短桿菌，具有D－氨基酰化酶活力的耐寒短桿菌此前未見報(bào)道。另外，對(duì)該菌株的發(fā)酵條件進(jìn)行了初步優(yōu)化，其最佳產(chǎn)酶發(fā)酵條件為：培養(yǎng)溫度30℃，培養(yǎng)基初始pH值7，搖床轉(zhuǎn)速200r·min－1，搖瓶裝樣量15%，培養(yǎng)時(shí)間48h。為實(shí)現(xiàn)國(guó)內(nèi)D－氨基?；傅纳唐坊懊阜ê铣蒁－氨基酸的工業(yè)化奠定了基礎(chǔ)。
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