為了確保食品的微生物質(zhì)量和安全，人們對(duì)使用預(yù)測(cè)模型來(lái)量化和預(yù)測(cè)微生物行為產(chǎn)生了興趣。不同的環(huán)境因素和防腐劑對(duì)絲狀真菌的生長(zhǎng)前的滯后期和生長(zhǎng)速度的影響是不同的。由于絲狀真菌的生長(zhǎng)習(xí)性，在絲狀真菌特別是產(chǎn)真菌毒素的菌種上進(jìn)行此類實(shí)驗(yàn)較為困難，本論文的研究的目的就是開(kāi)發(fā)一種自動(dòng)比濁儀度法（Bioscreen）快速篩選抗真菌化合物以及其對(duì)黃曲霉的初始生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)的影響，并利用提出的方法與LPM相聯(lián)系用于最低抑制濃度MIC和非抑制濃度(NIC)值的準(zhǔn)確定量來(lái)評(píng)價(jià)抗真菌化合物在不同環(huán)境下對(duì)黃曲霉的抑菌作用條件。
全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀的應(yīng)用
應(yīng)用全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀Bioscreen測(cè)試了絲狀真菌黃曲霉素中加入不同濃度的丙基丙烷硫代磺酸鹽(PTS)后對(duì)應(yīng)的生長(zhǎng)曲線圖（OD600），對(duì)比了絲狀真菌在不同不同環(huán)境下的生長(zhǎng)情況，并計(jì)算了它們?cè)诓煌瑮l件下的對(duì)應(yīng)的O600值上的差異。測(cè)試的生長(zhǎng)曲線的周期為7天，每隔20分鐘測(cè)試一次OD600值，培養(yǎng)過(guò)程中各菌株的搖晃、生長(zhǎng)及OD值的測(cè)試全是自動(dòng)完成的，從而篩選獲得抗真菌化合物PTS對(duì)絲狀真菌黃曲霉素的最低抑制濃度MIC和非抑制濃度(NIC)值。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
開(kāi)發(fā)了一種全自動(dòng)的比濁度法(Bioscreen C)檢測(cè)絲狀真菌黃曲霉在不同環(huán)境條件下的初始生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)，此種方法可快速篩選抗真菌化合物，并對(duì)其進(jìn)行生態(tài)生理學(xué)研究，并利用所提出的方法與LPM相聯(lián)系用于最低抑制濃度MIC和非抑制濃度(NIC)的計(jì)算，可準(zhǔn)確定量評(píng)價(jià)抗真菌化合物在不同環(huán)境下對(duì)黃曲霉的抑菌作用效果。研究表明建立的這種比濁度方法對(duì)于抗真菌化合物的快速篩選生長(zhǎng)和絲狀生物次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生的研究具有如縮短時(shí)間，所需培養(yǎng)基體積小等重要的優(yōu)勢(shì)來(lái)比較相關(guān)不同抗真菌化合物的療效。
圖1、在含有(A)0.2%和(B)0.125%w/v瓊脂的YES培養(yǎng)基中，接種了105/ml的A.flavus孢子(25 C)，獲得其對(duì)應(yīng)的生長(zhǎng)曲線圖。
圖2、含0.125%瓊脂w/v(25 C)的YES培養(yǎng)基中，初始濃度為102-106/ml的孢子的黃曲霉接種后獲得的平均生長(zhǎng)曲線圖(10條微生物的個(gè)體生長(zhǎng)曲線的平均值)
圖3、在Bioscreen C分析儀的100孔的微孔板加載不同體積的菌種后得到的平均生長(zhǎng)曲線(10條個(gè)體曲線平均值)。接種量為金黃色葡萄球菌105/ml，培養(yǎng)溫度為25℃。
圖4、通過(guò)兩次不同接種量的黃曲霉與外源黃曲霉在不同培養(yǎng)時(shí)間下的平均生物量比較。培養(yǎng)溫度為20℃。
圖5、不同條件下獲得的絲狀真菌的生長(zhǎng)曲線圖(5條個(gè)體曲線)，顯示獲得的生長(zhǎng)曲線是在不同溫度下，7天后在含有0.125%瓊脂w/v的YES培養(yǎng)基內(nèi)接種具有代表性濃度的PTS，接種濃度為105/ml的黃曲霉孢子。(A)25 C和0.995aw;(B)25 C和0.95aw;(C)20c和0.995aw;(D)20 c和0.995aw。
總結(jié)
本論文主要開(kāi)發(fā)了一種快速篩選抗真菌化合物，并進(jìn)行生態(tài)生理學(xué)研究的高通量方法，利用特殊的半固態(tài)培養(yǎng)基對(duì)絲狀真菌進(jìn)行了研究，采用分光光度/濁度法測(cè)量，所使用的儀器設(shè)備是Bioscreen C全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀，該儀器結(jié)合2塊100孔的微孔板可同時(shí)平行測(cè)試多個(gè)各種菌株樣品的生長(zhǎng)曲線，并且所有的過(guò)程都是自動(dòng)化的。本論文的研究人員全面研究了培養(yǎng)基的組成和制備，接種劑的大小，培養(yǎng)基體積和孵育參數(shù)等用于測(cè)量初始真菌的萌發(fā)和生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)的優(yōu)化，全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀Bioscreen C在本研究工作中主要是用于評(píng)估18種濃度的丙基丙烷硫代磺酸鹽(PTS)在不同的環(huán)境下對(duì)黃曲霉的抑制作用。研究過(guò)程采用了一種以前用于細(xì)菌抑制的數(shù)學(xué)模型方法，即超過(guò)7天的自動(dòng)化周期培養(yǎng)，每20分鐘測(cè)量一次，很好的獲得相關(guān)的最低抑制濃度(MIC)，并計(jì)算了非抑制濃度(NIC)值。從以上研究可以看出應(yīng)用全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀Bioscreen分析儀建立的這種篩選抗真菌類的方法對(duì)于快速篩選生長(zhǎng)和絲狀生物次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生和利用具有非常好的應(yīng)用前景，尤其是該設(shè)備能夠縮短測(cè)試時(shí)間，研究所需培養(yǎng)基體積量少，這也說(shuō)明全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀Bioscreen不僅可用于研究腐敗菌和致病菌，還可用于絲狀真菌病原體的生態(tài)生理學(xué)和抗真菌篩選,為相關(guān)微生物領(lǐng)域的研究人員在篩選各類微生物提供了重要的技術(shù)支持。
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