禽腺病毒(Fowl adenovirus，F(xiàn)AdV)屬于腺病毒科禽腺病毒屬。目前，基于限制性酶切圖譜分析和六鄰體序列，F(xiàn)AdV可分為5個基因型(A-E)；基于血清交叉中和試驗，將5個基因型又細分為12個血清型(1-7、8a、8b、9-11)。由血清4型禽腺病毒(FAdV-4)和血清11型禽腺病毒(FAdV-11)感染導致的肝炎-心包積液綜合征(HHS)和包涵體肝炎(IBH)給養(yǎng)禽業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。
目前針對禽腺病毒的防控，多利用真核表達系統(tǒng)表達特異性抗原蛋白，通過制備亞單位疫苗實現(xiàn)抗禽腺病毒感染的目的。例如FAdV-4的防控，利用桿狀病毒表達系統(tǒng)高效表達血清4型禽腺病毒Fiber-2蛋白制備亞單位疫苗，能有效阻斷病毒感染傳播途徑(CN112940084A)。針對FAdV-11的防控，將禽腺病毒fiber蛋白與雞骨髓源樹突狀細胞的靶向肽SP序列融合表達制備亞單位疫苗從而實現(xiàn)FAdV-11的精準防控(CN116789850A)。由于禽腺病毒感染常伴隨多種血清型出現(xiàn)，因此，需要針對多種血清型的禽腺病毒制備多聯(lián)疫苗。例如，公開號202310094554.1的專利公開了一種禽腺病毒病四價嵌合病毒樣顆粒，以新城疫病毒NA-1株的基質(zhì)蛋白M為骨架，將I群血清4型禽腺病毒的Fiber-2蛋白、I群血清8a型禽腺病毒的Fiber蛋白、I群血清8b型禽腺病毒的Fiber蛋白、I群血清11型禽腺病毒的Fiber蛋白分別嵌合于新城疫病毒樣顆粒載體NDVVLPs表面，得到該禽腺病毒病四價嵌合病毒樣顆粒，命名為FAdV4-8a-8b-11cVLPs。還有公開號為CN114214291A的專利構(gòu)建了一種表達禽腺病毒血清8b型纖突蛋白的禽腺病毒血清4型重組病毒，是利用FAdV-8b的Fiber基因替換FAdV-4Fiber1基因得到，該重組病毒可用于制備防控雞肝炎-心包積液綜合征和/或雞包涵體肝炎的二聯(lián)疫苗，利用本發(fā)明中的重組病毒制備的二聯(lián)疫苗可以達到打一針疫苗同時預防兩種疫病的效果。然而，目前還未有關(guān)于同時免疫防控血清4型禽腺病毒和血清11型禽腺病毒的相關(guān)疫苗的報道。
一種表達血清11型禽腺病毒Fiber蛋白的重組血清4型禽腺病毒，基于CRISPR-Cas9技術(shù)將血清11型禽腺病毒Fiber蛋白替換重組血清4型禽腺病毒中Fiber-2蛋白，為同時免疫防控血清4型禽腺病毒和血清11型禽腺病毒提供技術(shù)支撐和疫苗候選。
一種表達血清11型禽腺病毒Fiber蛋白的重組血清4型禽腺病毒的構(gòu)建方法
1.病毒基因組的制備：使用天根公司的DNA提取試劑盒進行提取，取血清11型禽腺病毒上清200μL于1.5mL指形管內(nèi)，按照DNA提取試劑盒說明書進行血清11型禽腺病毒基因組的提取。
2.供體質(zhì)粒的構(gòu)建：帶有血清4型禽腺病毒基因組左端同源臂HAL和右端同源臂HAR和帶有LoxP序列的RFP表達盒的供體質(zhì)粒HR1-RFP-HR2inpMD 19由本實驗室構(gòu)建并保存，具體的構(gòu)建方法見專利CN116286685A。然后以HR1-RFP-HR2 in pMD 19質(zhì)粒載體為模板，利用線性化引物將載體線性化(如圖1中B)，利用帶有質(zhì)粒部分序列血清11型fiber基因引物以血清11型禽腺病毒380毒株的DNA為模板擴增血清11型禽腺病毒的fiber基因(如圖1中B)，瓊脂糖凝膠電泳后進行膠回收，回收得到的線性化的載體和血清11型禽腺病毒的fiber基因在同源重組酶的作用下將fiber基因連接到HR1-RFP-HR2 in pMD 19質(zhì)粒上，最終獲得攜帶血清11型禽腺病毒fiber基因和RFP表達盒的供體質(zhì)粒。最終獲得的供體質(zhì)粒送南京擎科生物科技有限公司測序并由實驗室保存。構(gòu)建供體質(zhì)粒所用的引物序列見表1。
表1構(gòu)建供體質(zhì)粒所用的PCR引物
3.sgRNA表達載體的構(gòu)建：根據(jù)FAdV-4的fiber-2基因序列利用sgRNA在線設計網(wǎng)站(http://crispor.tefor.net/)進行sgRNA的設計。將設計好的sgRNA克隆到lentiCRISPRv2質(zhì)粒，通過測序進行sgRNA表達載體的驗證。具體的sgRNA序列見表2，由南京擎科生物科技有限公司合成。
表2針對Fiber-2基因的sgRNA序列
4.FAdV4-F11重組病毒的拯救：構(gòu)建策略如圖1中A。在6孔板中鋪LMH細胞，次日，將3μg sgRNA、3μg的供體質(zhì)粒以及6μL的轉(zhuǎn)染試劑Mirus加入到200μL的Opti-MEM中，室溫孵育45min。隨后加入到LMH細胞中，轉(zhuǎn)染6h后換成細胞生長液。轉(zhuǎn)染12h后，棄去細胞生長液，用0.1MOI的FA4-EGFP感染LMH細胞，感染2h后換成細胞維持液。感染FA4-EGFP 3天后，盲傳到新的LMH細胞，培養(yǎng)幾天后用熒光顯微鏡觀察，若有紅色熒光簇出現(xiàn)(如圖2中A)證明重組病毒初步構(gòu)建成功。
隨后在96孔細胞板上利用多輪有限稀釋，每次均挑取無綠色熒光有紅色熒光的細胞，直至綠色熒光完全消失，獲得帶有RFP表達盒的表達血清11型禽腺病毒Fiber蛋白的重組血清4型禽腺病毒，并命名為FAdV4-F11-RFP。獲得的純化后的紅色熒光重組病毒倍比稀釋后接種轉(zhuǎn)染Cre重組酶的96孔LMH細胞板上，2～3d后通過熒光顯微鏡觀察，挑取有細胞病變但無紅色熒光的細胞，繼續(xù)接種轉(zhuǎn)染Cre重組酶的96孔LMH細胞板，重復數(shù)次直至紅色熒光完全消失獲得刪除RFP表達盒的重組病毒，命名為FAdV4-F11。通過PCR對獲得重組病毒FAdV4-F11進行鑒定(如圖2中B)，PCR所用的引物見表3。
表3PCR鑒定重組病毒的引物
5.重組病毒中血清11型Fiber蛋白的表達鑒定：用0.1MOI的重組病毒感染LMH細胞，感染2h后換成細胞維持液。感染病毒3天后，用含有蛋白酶磷酸酶抑制劑的細胞裂解液裂解細胞，加入蛋白上樣buff煮樣后利用血清11型禽腺病毒Fiber鼠多抗和Hexon單抗進行WB驗證。
結(jié)果如圖3中A，F(xiàn)AdV4-F11-RFP與FAdV4-F11均能檢測到血清11型禽腺病毒Fiber蛋白和Hexon蛋白。而陰性對照FAdV4-EGFP僅能檢測到Hexon蛋白的表達。
進一步用0.01MOI純化后不帶RFP表達盒的重組病毒接種LMH細胞，3天后將LMH細胞進行固定，利用針對血清11型Fiber鼠多抗和針對FAdV-4Fiber-1蛋白的單抗3B5進行IFA鑒定。
結(jié)果如圖3中B，重組病毒FAdV4-F11可檢測到血清11型禽腺病毒Fiber蛋白和FAdV-4Fiber-1蛋白，表明血清11型禽腺病毒Fiber蛋白成功插入FAdV-4中，并獲得良好表達。
6.刪除RFP表達盒的重組病毒的生長曲線測定：在6孔板中鋪LMH細胞，次日分別用0.1MOI的野生型FAdV-4和重組病毒接種LMH細胞，2h后換成1％維持液，感染后24h、48h、72h、96h和120h收取細胞上清。之后利用TCID50測定病毒各個時間點的病毒滴度，繪制病毒的生長曲線。
圖為重組病毒FAdV4-F11的生長曲線和穩(wěn)定性結(jié)果；A：重組病毒FAdV4-F11的生長曲線；B和C：通過PCR(B)和WB(C)鑒定FAdV4-F11的穩(wěn)定；M:marker；1～6：第2代、第4代、第6代、第8代、第10代、第12代重組病毒FAdV4-F11。
結(jié)果如圖4中A，重組病毒FAdV4-F11在LMH細胞上高效復制，在第5天病毒滴度最高達到109.6
TCID50/mL，遠遠強于野生型FAdV-4的生長速度和滴度。
7.刪除RFP表達盒的重組病毒的穩(wěn)定性測試：將重組病毒FAdV4-F11進行連續(xù)傳代12代，每隔2代進行提基因組和WB鑒定。
結(jié)果如圖4中B和C所示，重組病毒FAdV4-F11在LMH細胞中進行穩(wěn)定復制，并且在第2，4，6，8，10，12代病毒用針對血清11型禽腺病毒Fiber蛋白的鼠多抗進行WB實驗均能檢測到血清11型禽腺病毒Fiber蛋白，表明連續(xù)傳代后的重組病毒可以穩(wěn)定表達血清11型禽腺病毒Fiber蛋白。
8.滅活重組病毒FAdV4-F11在SPF雞中的免疫原性研究：為了評估滅活重組病毒的免疫原性，將12只14日齡SPF雞隨機分為兩組(每組6只)。實驗組每只雞肌肉注射含有106TCID50的滅活油乳劑FAdV4-F110.3mL，對照組雞肌肉注射含油乳劑的細胞培養(yǎng)基。每天監(jiān)測兩組雞的臨床癥狀和死亡率，并在14dpi采集血樣并用于檢測FAdV-4和FAdV-11的中和抗體。
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