作為一種重要的食源性病原體，李斯特菌廣泛分布于自然環(huán)境中，常從各種食物中分離出來。這種細(xì)菌可引起人類李斯特菌病，具有典型的臨床癥狀，如敗血癥和腦膜炎。單核細(xì)胞增生李斯特菌作為一種食品相關(guān)病原體，能夠在食品接觸的不同表面形成生物膜，嚴(yán)重威脅食品安全。苯乳酸(PLA)是一種小分子有機(jī)酸，天然存在于蜂蜜和一些由乳酸菌發(fā)酵生產(chǎn)的產(chǎn)品中。PLA可以抑制許多革蘭氏陽性菌（如單核細(xì)胞增生李斯特菌和金黃色葡萄球菌）和革蘭氏陰性菌如熒光假單胞菌、副溶血性弧菌和大腸桿菌。苯乳酸(PLA)對包括單核細(xì)胞增生李斯特氏在內(nèi)的許多細(xì)菌菌株表現(xiàn)出極好的抑制作用。
本研究旨在研究PLA對單核細(xì)胞增生李斯特菌生物膜及其在牛奶和五香牛肉中的生長的影響。采用微孔板法測定了生物膜的生物量，電鏡觀察生物膜結(jié)構(gòu)。并通過菌落計(jì)數(shù)確定食品樣品中單核細(xì)胞增生李斯特菌生長瓊脂稀釋法的結(jié)果表明，單核細(xì)胞增生李斯特菌10403S的PLA最低抑菌濃度(MIC)值為6 mg/ml。亞抑制濃度的PLA可以通過減少單核細(xì)胞增生李斯特菌中胞外多糖和細(xì)胞外蛋白的分泌來抑制生物膜的形成。研究結(jié)果表明PLA能夠抑制牛奶和香料牛肉中單核細(xì)胞增生李斯特菌的生長。PLA有潛力作為替代抗菌劑來控制食品工業(yè)中的單核細(xì)胞增生李斯特菌污染及其生物膜。
對于單核增生李斯特菌生長過程測量，使在不存在或存在PLA（1/10MIC、1/8MIC、1/4MIC和1/2MIC）的情況下，將單核細(xì)胞增生李斯特菌10403S接種到BHI肉湯中。將菌株的五個菌落分別接種到BHI肉湯中并孵育。然后將細(xì)菌培養(yǎng)物在補(bǔ)充有不同濃度PLA的BHI中稀釋。將樣品在用Bioscreen C全自動生長曲線分析儀(芬蘭）中在37°C下孵育48小時，每小時測量一次OD 600nm，生成細(xì)菌的微生物生長曲線。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果：本研究確定了PLA對單核細(xì)胞增生李斯特菌生物膜的影響，包括生物膜形成、成熟生物膜和生物膜EPS。確定PLA對單核細(xì)胞增生李斯特菌運(yùn)動性和毒力相關(guān)基因的運(yùn)動性、毒力和表達(dá)的影響。PLA可以通過減少胞外多糖和胞外蛋白來抑制單核細(xì)胞增生李斯特菌的生物膜形成并去除成熟的生物膜，表明PLA對單核細(xì)胞增生李斯特菌具有抗生物膜活性。此外，PLA對牛奶和香料牛肉中的單核細(xì)胞增生李斯特菌生長有抑制作用。研究數(shù)據(jù)表明，PLA具有作為控制食品工業(yè)中單核細(xì)胞增生李斯特菌污染及其生物膜的替代抗菌劑的潛力。
圖1、核細(xì)胞增生李斯特菌10403S在不同濃度PLA的BHI中的生長曲線。當(dāng)暴露于1/2MIC的PLA時，菌株生長受損，滯后期延長9.5%(P<0.05)，最大生長速率降低62.8%。
圖2、在有和沒有PLA的BHI中，單核細(xì)胞增生李斯特菌10403S的平均滯后期持續(xù)時間、平均最大生長速率和平均最大光密度(0D)。
圖3、PLA對單核細(xì)胞增生李斯特菌10403S生物膜基質(zhì)中EPS含量的影響。將生物膜在PLA（分別為1/10MIC、1/8MIC和1/4MIC）存在下孵育48小時，然后將生物膜中(A)胞外多糖、(B)細(xì)胞外蛋白和(C)細(xì)胞外DNA的量被確定了。在暴露于PLA（分別為1/2MIC、1×MIC和2×MIC）4小時后，對成熟生物膜中(D)胞外多糖、(E)胞外蛋白和(F)胞外DNA的含量進(jìn)行定量。
圖4、PLA對(A)溶血活性、(B)附著能力和(C)侵入Caco-2細(xì)胞的影響。
圖5、單核細(xì)胞增生李斯特菌10403S(A)在UHT全脂牛奶和(B)添加PLA的巴氏殺菌牛奶中的菌落計(jì)數(shù)，以及(C)在浸涂PLA后在五香牛肉上的菌落計(jì)數(shù)。
總結(jié)：PLA作為一種安全、天然的抗菌劑，被認(rèn)為是一種替代防腐劑，在食品工業(yè)中有著廣泛的應(yīng)用前景。本研究使用Bioscreen全自動生長曲線分析儀評估了PLA對控制食品中單核細(xì)胞增生李斯特菌生長的影響。當(dāng)添加到UHT全脂和巴氏殺菌牛奶中時，3 mg/ml的PLA在4°C下儲存14天后有效抑制了單核細(xì)胞增生李斯特菌的生長。對于五香牛肉的表面應(yīng)用，研究中使用了更高濃度的PLA。當(dāng)濃度≥3 mg/ml的PLA在作為浸漬劑使用時，在儲存期間顯著降低了五香牛肉樣品上的單核細(xì)胞增生李斯特菌計(jì)數(shù)。PLA具有獨(dú)特的氣味特征，在使用時會影響食品的感官特性。因此，需要進(jìn)一步研究以確定既能具有良好的抗菌活性又能獲得令人滿意的食品感官特性的PLA的適當(dāng)抑制濃度。PLA與其他抗菌劑或物理方法相結(jié)合，將有利于提高其在食品保鮮中的應(yīng)用效果。
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