【摘要】：隨著工業(yè)化的進展，城市生活垃圾已經不僅只包含有機化合物，越來越多的人工合成的化合物也被排放到環(huán)境中，有些化合物含有劇毒，有致癌的作用，而且很難自然降解。這些有害的物質隨著垃圾滲透液，對周圍地下水和土壤造成了嚴重的污染。治理環(huán)境污染已經成為世界各國努力攻克的難題?？茖W家們治理環(huán)境采用的是化學、物理方法結合生物方法來處理污染物。近年來，科學家們針對不同的污染物采用不同的治理方法，其中微生物方法治理環(huán)境具有明顯的優(yōu)勢。但是由于人們日常生活中基本上不對垃圾進行分類，導致了生活垃圾滲透液中金屬離子含量很高，一些降解垃圾的菌株抗性差，處理垃圾效果不明顯。因此亟待開發(fā)出一種高表達的、抗性強的，且能夠降解垃圾滲透液污染物的優(yōu)良菌株。
已經有研究報道短小芽孢桿菌對降解垃圾有很好的效果，且短小芽孢桿菌由于繁殖速度快，能產生穩(wěn)定的芽孢，抗逆能力強，成為了越來越受矚目的生防材料之一。短小芽孢桿菌的生長受外部環(huán)境的影響，環(huán)境不適宜生長的情況下，就會由營養(yǎng)細胞轉變?yōu)檠挎?，處于休眠狀態(tài)，不能高效快速生長。碳源、氮源和無機鹽都會影響菌體的生長。因此需要篩選出滿足其生長的最佳碳源、氮源、無機鹽及最優(yōu)生長條件。
本研究針對短小芽孢桿菌的16S rRNA基因堿基序列和gyrA、rpoA基因序列設計了6對特異性引物，通過對填埋場垃圾滲透液中分離得到的菌株，進行生理實驗和特異性PCR擴增反應來分離篩選鑒定得到短小芽孢桿菌。通過單因素實驗確定了短小芽孢桿菌所需的最適培養(yǎng)基組分，通過正交實驗確定出最適培養(yǎng)基組分的最佳配比。在最適培養(yǎng)基的基礎上，進行發(fā)酵培養(yǎng)，優(yōu)化最佳發(fā)酵條件。得到短小芽孢桿菌生長所需的最優(yōu)培養(yǎng)基及最佳發(fā)酵條件。從垃圾滲透液中分離得到的菌株細胞呈現桿狀，革蘭氏陽性，通過對菌株進行特異性PCR擴增反應，分析電泳結果圖，確定菌株為短小芽孢桿菌。
該方法可以方便、快捷地分析檢測出短小芽孢桿菌，避免了進行16S rRNA基因序列的測序以及數據庫比對分析的步驟。通過單因素實驗確定了短小芽孢桿菌最佳培養(yǎng)基的成分為：玉米淀粉，酵母提取物，MgSO4·7H2O。利用正交實驗設計優(yōu)化了短小芽孢桿菌的培養(yǎng)基，得到最適培養(yǎng)基為：玉米淀粉0.1%，酵母提取物1.0%，MgSO4·7H2O0.49%，小牛浸膏0.3%，NaCl0.5%。并通過單因素實驗法確定了最佳培養(yǎng)條件，溫度37℃，初始pH7.2，接種量為5%。采用最優(yōu)培養(yǎng)基和基礎培養(yǎng)基分別在搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件下培養(yǎng)10h。測得OD320值由1.44增長為6.93。生長量提高了將近4.8倍。通過篩選得到的短小芽孢桿菌需要制成制劑大量投入使用。
芽孢比營養(yǎng)細胞易保存，復活率高，是影響短小芽孢桿菌制劑效果的關鍵因素是芽孢的含量，因此要研究得到形成芽孢的條件。有報道培養(yǎng)基中含有錳離子對短小芽孢桿菌形成芽孢是有利的，一定濃度的錳離子可以促進菌體和芽孢的生長。所以本實驗對不同濃度錳離子對短小芽胞桿菌的芽胞產率的影響進行了研究，以期在活菌含量高的同時獲得較高的芽胞產量，為短小芽孢桿菌制劑的產業(yè)化生產提供基礎。經研究得到在最優(yōu)培養(yǎng)基中加入0.007%的Mn2+能夠提高活菌數和芽孢數，此時芽孢率最大。
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