討論
對(duì)革蘭氏陰性惡臭假單胞菌功能基因組學(xué)的研究揭示了細(xì)胞生理學(xué)基本概念的寶貴見解。惡臭假單胞菌屬于能夠利用多種有機(jī)化合物作為唯一碳源和氮源的微生物。其中許多已經(jīng)獲得了利用有毒和異生物質(zhì)生長(zhǎng)的能力。它們?cè)谙廴舅w和土壤中的有機(jī)廢物方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。
最近，這類微生物對(duì)尼古丁的降解因其在解毒煙草廢物方面的巨大潛力而受到越來越多的關(guān)注（圖7A、7B和7C），并進(jìn)行了相關(guān)的細(xì)胞生長(zhǎng)和靜息細(xì)胞反應(yīng)（圖7和圖8）。nicA1基因缺失突變體在尼古丁培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好，與野生型S16菌株相同（圖8A、8B和8C），而nicA2基因缺失突變體不能在尼古丁培養(yǎng)基中生長(zhǎng)（圖7和圖8C）。刪除nicA2而非nicA1阻止了尼古丁分解代謝，證明了新發(fā)現(xiàn)的NicA2的重要性。對(duì)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的同源性搜索顯示，NicA2的氨基酸序列與節(jié)桿菌屬尼古丁vorans的6-羥基-L-尼古丁氧化酶、節(jié)桿菌屬尼古丁vorans的6-羥基-D-尼古丁氧化酶以及假單胞菌屬菌株HZN6的尼古丁氧化酶的氨基酸序列分別具有23.6%、12.0%和82.0%的同一性?？偟膩碚f，這10個(gè)尼古丁誘導(dǎo)基因有助于清晰理解惡臭假單胞菌S16尼古丁降解中未知的分解代謝途徑。對(duì)本研究產(chǎn)生的蛋白質(zhì)組譜的比較分析揭示了廣泛的細(xì)胞過程和功能，其中一些最深刻的表達(dá)變化發(fā)生在具有氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)、能量產(chǎn)生、細(xì)胞壁膜和包膜生物發(fā)生等功能作用的注釋功能蛋白中，例如基因porin和mfs（表S2，圖S1和圖2）。該方案的成功應(yīng)用導(dǎo)致了對(duì)惡臭假單胞菌對(duì)尼古丁全局反應(yīng)的擴(kuò)展和精煉。
在過去幾年中，通過不同方法鑒定SP羥基化關(guān)鍵基因的努力均未成功。最終在本研究中，借助比較蛋白質(zhì)組和遺傳分析，新鑒定并表征了惡臭假單胞菌的spmA、B和C基因。這些基因編碼3-琥珀酰吡啶單加氧酶，該酶將SP羥基化為HSP，作為尼古丁降解的一個(gè)步驟。Spm所有部分的氨基酸序列與各種原核含鉬羥基化酶和真核黃嘌呤脫氫酶顯示出顯著的同源性。在重組惡臭假單胞菌S16dspm中實(shí)現(xiàn)了spmA、B和C基因的表達(dá)以及催化活性SP單加氧酶的形成。在含有重組質(zhì)粒pET28a-spmABC的相應(yīng)大腸桿菌BL21(DE3)中檢測(cè)活性酶的嘗試未成功，這一結(jié)果與先前研究惡臭假單胞菌86中參與喹啉降解的基因qorM、S和L的工作相似，也與節(jié)桿菌屬尼古丁vorans中pAO1編碼的尼古丁脫氫酶基因在尼古丁降解中的另一結(jié)果相似。
當(dāng)Spm基因在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)，可能導(dǎo)致形成缺乏鉬蝶呤胞嘧啶二核苷酸輔因子(Mo-MCD)的無活性3-琥珀酰吡啶單加氧酶。在大腸桿菌中，輔因子是鉬蝶呤鳥嘌呤二核苷酸(MGD)作為鉬輔因子的有機(jī)部分，而其他細(xì)菌利用Mo-MCD輔因子。因此，無法將Mo-MCD輔因子整合到功能性脫輔基蛋白中。這解釋了為什么我們?cè)谶^去幾年中使用其他幾種方法（例如構(gòu)建基因組文庫(kù)、克隆基因和在大腸桿菌中表達(dá)）未能獲得spm基因。上述觀察表明，Spm是一種新型的含Mo-MCD的三亞基羥基化酶，參與假單胞菌屬的尼古丁降解。據(jù)我們所知，假單胞菌屬HZN6中的sirA2(243 bp)是唯一報(bào)道的與SP降解相關(guān)的基因。SirA2，80個(gè)氨基酸殘基，是一種硫轉(zhuǎn)移酶，是形成鉬蝶呤輔因子和吡啶環(huán)功能性羥基化酶所必需的。然而，惡臭假單胞菌S16中的Spm負(fù)責(zé)將SP羥基化為HSP，并且Mo-MCD對(duì)惡臭假單胞菌S16中的Spm至關(guān)重要。我們目前的研究有助于闡明惡臭假單胞菌S16的整個(gè)尼古丁降解途徑，并進(jìn)一步理解假單胞菌中尼古丁代謝的分子水平機(jī)制。
所有這些機(jī)制見解可以擴(kuò)展到假單胞菌對(duì)環(huán)境的適應(yīng)，可能在生物降解、生物修復(fù)和生物催化劑方面產(chǎn)生影響。本文提供的2D LC/MS數(shù)據(jù)的可用性將允許更有針對(duì)性地搜索在特定細(xì)胞活動(dòng)期間差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。檢查蛋白質(zhì)組和相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)是理解環(huán)境污染物和毒物分解代謝中涉及的分子變化的有用方法。
相關(guān)新聞推薦
1、沒食子酸、原兒茶酸、綠原酸3種酚酸對(duì)腐敗希瓦氏菌的抑制作用與機(jī)制（一）
3、貯藏溫度對(duì)鮮切草魚薄片中熱死環(huán)絲菌的生長(zhǎng)速率影響（二）