2.4.生物膜形成
近平滑念珠菌和克魯斯念珠菌生物膜在商業(yè)可得的預(yù)滅菌聚苯乙烯平底96孔微孔板上形成。向板每孔加入210μl生長培養(yǎng)基中的標(biāo)準(zhǔn)酵母細(xì)胞懸浮液（OD600 nm=0.8）和70μl麥芽提取物培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)對每種濃度進(jìn)行十六個(gè)重復(fù)孔。
2.5.藥物對粘附的效率
為了研究天然物質(zhì)或抗生素對初始細(xì)胞粘附的影響，其中一種物質(zhì)從一開始就與標(biāo)準(zhǔn)酵母細(xì)胞懸浮液一起加入孔中。微孔板用蓋子覆蓋并在30°C、150 rpm孵化24小時(shí)。
2.6.藥物對生物膜發(fā)展的效率
為了研究天然物質(zhì)或抗生素對生物膜發(fā)展的影響，含標(biāo)準(zhǔn)酵母懸浮液的微孔板培養(yǎng)24小時(shí)，然后加入其中一種物質(zhì)。在藥物加入前不洗滌孔以模擬天然作用機(jī)制的條件，其中物質(zhì)與粘附和懸浮細(xì)胞相互作用。微孔板用蓋子覆蓋并在30°C、150 rpm孵化24小時(shí)。
2.7.藥物對預(yù)形成生物膜的效率
為了研究天然物質(zhì)或抗生素對預(yù)形成生物膜根除的影響，含標(biāo)準(zhǔn)酵母細(xì)胞懸浮液的微孔板培養(yǎng)24小時(shí)，然后每孔用鹽水洗滌三次。然后向每孔加入適當(dāng)濃度溶解于麥芽提取物培養(yǎng)基中的一種物質(zhì)，培養(yǎng)再進(jìn)行24小時(shí)。微孔板用蓋子覆蓋并在30°C、150 rpm孵化24小時(shí)。
2.8.Cellavista設(shè)備
Cellavista是全自動(dòng)細(xì)胞成像儀，具備明場和三個(gè)熒光通道（標(biāo)準(zhǔn)集包括七個(gè)激發(fā)波長及相應(yīng)濾波器）。光學(xué)系統(tǒng)由四個(gè)物鏡組成：2x、4x、10x、20x和40x，以及提供4 Mpixel圖像的CCD相機(jī)。Cellavista可評(píng)估6-384微孔板以及培養(yǎng)皿和顯微鏡載玻片。
一系列預(yù)定義應(yīng)用可用（細(xì)胞融合度、懸浮細(xì)胞計(jì)數(shù)、細(xì)胞核等）。每個(gè)測定提供相關(guān)的圖像處理算法，由算法評(píng)估的特定對象類型定義。參數(shù)評(píng)估設(shè)置可由用戶為每個(gè)測定修改。
對于圖像獲取，微孔板放入設(shè)備中，可手動(dòng)調(diào)整正確圖像設(shè)置（曝光時(shí)間、光強(qiáng)度、增益、聚焦偏移）。然后掃描所選微孔板孔，圖像自動(dòng)拼接產(chǎn)生整個(gè)孔的圖像。根據(jù)所選測定和用戶定義參數(shù)，圖像分析隨后通過Cellavista評(píng)估算法對每個(gè)測定進(jìn)行自動(dòng)一致閾值處理。取決于測定類型，可為圖像分析設(shè)置不同參數(shù)：例如細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞融合度、細(xì)胞或菌落大小和形態(tài)以及熒光應(yīng)用中的熒光強(qiáng)度。設(shè)備還提供模板功能，允許一致評(píng)估相同布局的實(shí)驗(yàn)而無需手動(dòng)調(diào)整。以二進(jìn)制圖像形式的結(jié)果（評(píng)估對象高亮）可作為所有圖像的馬賽克查看每個(gè)細(xì)胞（參見圖1，描繪為時(shí)間過程）。對于96孔板，每孔可拍攝的最大圖像數(shù)量見表1。
2.9.使用Cellavista設(shè)備評(píng)估藥物效率
為了評(píng)估黃芩素、殼聚糖、地衣酸或兩性霉素B對酵母生物膜形成不同階段的影響，制備的96孔微孔板每孔用鹽水洗滌三次，然后插入Cellavista自動(dòng)顯微鏡，其中拍攝每孔底部中心二十五張照片（20x物鏡）。這些圖像通過Cellavista圖像分析軟件評(píng)估，確定參數(shù)：對比度、最小區(qū)域亮度、強(qiáng)度、靈敏度和大小。天然物質(zhì)或抗生素對生物膜形成的影響與陰性對照（無藥物培養(yǎng)）比較。所有實(shí)驗(yàn)中對照指定為100%以允許直接比較研究物質(zhì)影響。
2.10.統(tǒng)計(jì)分析
對照和物質(zhì)對粘附抑制、生物膜發(fā)展和預(yù)形成生物膜效率差異的顯著性通過單因素方差分析和Tukey's HSD檢驗(yàn)確定。
3.結(jié)果與討論
3.1.抗真菌活性
生物膜的形成本質(zhì)上與念珠菌屬引起的慢性感染相關(guān)。許多研究已證實(shí)固著細(xì)胞對大多數(shù)可用抗生素的敏感性降低。因此發(fā)現(xiàn)和開發(fā)新的治療劑至關(guān)重要。天然產(chǎn)物能夠干擾生物膜形成的所有階段。它們可以影響環(huán)境的物理化學(xué)性質(zhì)、改變細(xì)胞包膜結(jié)構(gòu)或干擾生物膜形成的調(diào)控系統(tǒng)。所有這些過程可以干擾細(xì)胞粘附和生物膜形成。由于天然物質(zhì)與生物膜相互作用的機(jī)制復(fù)雜且通常屬特異性，在特定微生物和條件下評(píng)估和描述它們的需求至關(guān)重要。
本研究選擇了已知干擾生物膜形成的天然物質(zhì)。低濃度黃芩素能夠抑制白念珠菌生物膜形成，殼聚糖對多種微生物表現(xiàn)出抗菌活性，包括白念珠菌生物膜。地衣酸被描述為近平滑念珠菌固著細(xì)胞生長的有效抑制劑。
它們對研究近平滑念珠菌和克魯斯念珠菌菌株的抗真菌活性測定為最小抑制濃度，顯示在表2中。觀察到的MICs完全在兩種物種通常觀察值范圍內(nèi)。
為了評(píng)估測試化合物對固著細(xì)胞的活性，進(jìn)行了一系列濃度范圍的初步實(shí)驗(yàn)，有效濃度結(jié)果顯示在圖2中。化合物效果以百分比（條形）描繪，相對于對照實(shí)驗(yàn)（指定為100%），因此低于100%的值代表細(xì)胞覆蓋區(qū)域降低，超過100%的值指出物質(zhì)影響增加生物膜覆蓋度的實(shí)例。評(píng)估后選定的二進(jìn)制圖像（黑色區(qū)域代表生物膜）在條形圖下方記錄所有圖中生物膜生物量的排列：物質(zhì)對粘附的效率（行A）；物質(zhì)對生物膜發(fā)展的效率（圖像行B）；物質(zhì)對預(yù)形成生物膜的效率（圖像行C）。
每個(gè)單獨(dú)圖像是拼接圖像集，顯示一個(gè)孔的中心表面——是由Cellavista評(píng)估的25張圖像的編譯。在研究天然化合物中，殼聚糖和黃芩素在低濃度下影響粘附或預(yù)形成生物膜，但地衣酸即使在300μg ml?1濃度下也未表現(xiàn)出足夠的抗生物膜特性，因此被排除其他測試（單因素方差分析：近平滑念珠菌粘附抑制P=0.67，生物膜發(fā)展P=0.014，預(yù)形成生物膜P=0.15）。生物膜排列在所有對照實(shí)驗(yàn)中兩種研究微生物中均勻。在大多數(shù)情況下，物質(zhì)影響并均勻降低覆蓋區(qū)域，除黃芩素外，其存在導(dǎo)致簇形成（白圈高亮），即使總覆蓋區(qū)域降低，特別是在近平滑念珠菌生物膜發(fā)展實(shí)驗(yàn)中（行B，第二列）。
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