2.3.最低抑菌濃度（MIC）與棋盤法檢測
MIC assays 如先前描述進(jìn)行。GIB-C1141144 和 GRI-C1210932的孵育時(shí)間延長至48小時(shí)，因?yàn)檫@些菌株生長比K56-2慢得多。棋盤格 assays 用抗生素組合進(jìn)行。當(dāng)可以確定MIC時(shí)（新生霉素、氯新生霉素和妥布霉素），使用在1/32x MIC和MIC值之間以兩倍遞增的濃度。例如，如果某菌株的新生霉素MIC為16μg/mL，則在棋盤格 assay中測試0.5、1、2、4、8和16μg/mL的濃度。無法準(zhǔn)確確定PMB和粘菌素對BCC細(xì)菌的MIC，因?yàn)檫@些細(xì)菌在生長培養(yǎng)基中高于這些化合物的溶解度濃度下生長。所有BCC菌株在1024μg/mL PMB和粘菌素中生長，這是測試的最高濃度。這些被視為所有檢查BCC菌株的MIC的一半。
在棋盤格 assays中，PMB和粘菌素在64（1/32x MIC）、128（1/16x MIC）、256（1/8x MIC）、512（1/4x MIC）和1024μg/mL（1/2x MIC）濃度下測試。分?jǐn)?shù)抑制濃度指數(shù)（FICI）計(jì)算為 FICI = [(A)/MICA] + [(B)/MICB]，其中(A)和(B)是藥物A和B在組合中抑制細(xì)菌生長所需的MIC，MICA和MICB是藥物A和B單獨(dú)的MIC。FICI ≤0.5被視為協(xié)同作用。對于協(xié)同研究，所有抗生素來自獨(dú)立供應(yīng)商：新生霉素（>90%純）、PMB（>60%純）、粘菌素（>50%純）和妥布霉素（>98%純）購自Sigma（St Louis, MO）。商業(yè)級氯新生霉素由Rhone-Poulenc Santé捐贈。新生霉素和氯新生霉素對實(shí)驗(yàn)BCC菌株組的MIC也使用常規(guī)肉湯稀釋法確定。MIC和棋盤格實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)最多四次。在重復(fù)之間獲得多個值的情況下，報(bào)告較大（更保守）的值。
3.結(jié)果
3.1.小分子篩選多粘菌素B協(xié)同劑
圖1.從2686種化合物庫中，5種化合物顯示出與500μg/mL多粘菌素B（PMB）對洋蔥伯克霍爾德菌K56-2的協(xié)同效應(yīng)。結(jié)果以化合物存在下的生長抑制百分比表示，相對于無化合物時(shí)（無論是單獨(dú)使用，x軸）或與PMB組合使用（y軸）。黑點(diǎn)代表每種化合物。紅點(diǎn)代表所有未添加庫化合物的孔的結(jié)果（每板一孔）。被認(rèn)為單獨(dú)顯著抑制或與PMB協(xié)同的化合物必須抑制生長≥70%（虛線表示，陰影區(qū)域代表更高抑制水平）。點(diǎn)線斜率為1并通過原點(diǎn)；僅用于說明目的。左上象限的點(diǎn)代表在測試濃度下不直接抑制洋蔥伯克霍爾德菌生長但與PMB協(xié)同的化合物。右下象限的點(diǎn)代表抑制洋蔥伯克霍爾德菌但被PMB拮抗的化合物。右上象限靠近線的點(diǎn)代表抑制洋蔥伯克霍爾德菌但不增加或減少PMB效應(yīng)的化合物?；衔餅椋ˋ）IKD-8344、（B）新生霉素、（C）CL0231、（D）micacocidin B和（E）thielavin B。
在測試濃度（1μg/mL）下，無PMB時(shí)，2686種海洋來源化合物中無一對細(xì)菌細(xì)胞有顯著抑制作用（圖1）。無PMB時(shí)的最高抑制為22.8%。在這些條件下，該庫化合物直接抑制洋蔥伯克霍爾德菌菌株K56-2的命中率為0%（0/2686）。這并不排除它們在更高濃度下可能具有直接抗生素活性。如下所述，庫中一種化合物是新生霉素，如果庫濃度為20μg/mL，則會觀察到無PMB時(shí)的細(xì)菌生長抑制。
篩選揭示了五種化合物能有效增強(qiáng)PMB對洋蔥伯克霍爾德菌K56-2的抗微生物活性（圖1）。它們各自與PMB的組合在20小時(shí)時(shí)相對于單獨(dú)PMB的生長抑制≥70%。與PMB協(xié)同的化合物命中率為0.2%（5/2686）。這些化合物是thielavin B（圖2A）、micacocidin B（圖2B）、IKD-8344（圖2C）、一種新化合物CL0231（圖2D）和新生霉素（圖2F）。庫中存在三種與micacocidin B結(jié)構(gòu)相似但不與金屬復(fù)合的化合物，但它們均無與PMB對洋蔥伯克霍爾德菌的協(xié)同作用。這提供了一個內(nèi)部對照，表明micacocidin B中的金屬是其活性所必需的。一種與CL0231相似的化合物（CL0236；圖2E）其中纈氨酸被苯丙氨酸取代，無與PMB的協(xié)同作用，表明CL0231及相關(guān)化合物的生物活性取決于其氨基酸序列。在這五種化合物中，新生霉素和IKD-8344的活性在后續(xù)研究中得到確認(rèn)（確認(rèn)率40%；2/5），因?yàn)槲覀儫o法獲得其他三種化合物的足夠量來重復(fù)assays。
圖2.文中討論的化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)：（A）thielavin B；（B）micacocidin B；（C）IKD-8344；（D）CL0231；（E）CL0236；（F）新生霉素；和（G）氯新生霉素。結(jié)構(gòu)使用Marvin Sketch v.14.12.8繪制。
3.2.新生霉素和多粘菌素B對其他伯克霍爾德菌分離株的協(xié)同作用
我們評估了新生霉素對洋蔥伯克霍爾德菌K56-2的協(xié)同效應(yīng)是否也發(fā)生在其他臨床BCC分離株中，包括多重伯克霍爾德菌菌株C0514和兩株妥布霉素耐藥的BCC分離株（GIB-C1141144和GRI-C1210932）。除了測試PMB，還包括粘菌素和妥布霉素，因?yàn)檫@些抗生素的霧化制劑用于治療CF患者的肺部細(xì)菌感染。我們首先確定了這些BCC菌株的個體MIC。它們所有的新生霉素MIC均為16μg/mL，遠(yuǎn)低于銅綠假單胞菌PAO1（512μg/mL）和大腸桿菌DH5a（128μg/mL）的值。BCC細(xì)菌在測試的最高濃度（1024μg/mL）下生長，用于PMB和粘菌素。最后，BCC分離株GIB-C1141144和GRI-C1210932對妥布霉素的耐藥性顯著高于K56-2或C0514（MIC分別為2048μg/mL和4096μg/mL）。
進(jìn)行棋盤格assays以量化協(xié)同水平。由于所有BCC細(xì)菌對PMB和粘菌素的MIC大于測試的最高濃度（1024μg/mL），我們經(jīng)驗(yàn)性地將1024μg/mL視為MIC的一半。新生霉素與PMB和粘菌素對測試的BCC菌株均表現(xiàn)出協(xié)同作用（表1）。新生霉素與AMPs對革蘭氏陰性菌的協(xié)同作用先前已有報(bào)道。新生霉素略微增強(qiáng)了妥布霉素對K56-2和C0514的活性，但FICI大于0.5（表1）。相反，亞MIC濃度的妥布霉素拮抗了新生霉素對妥布霉素耐藥分離株GIB-C1141144和GRI-C1210932的活性（FICI大于1）。我們推測亞MIC濃度的妥布霉素在這些菌株中激活了一種機(jī)制，提供對新生霉素的交叉耐藥性。
由于我們目前無法從海洋來源提取更高濃度的這些化合物，且大多數(shù)化合物缺乏替代來源，無法對初始篩選檢測到的其他協(xié)同化合物進(jìn)行類似實(shí)驗(yàn)。這些化合物從其生產(chǎn)者生物發(fā)酵、從重組表達(dá)系統(tǒng)過量生產(chǎn)或化學(xué)合成是未來進(jìn)一步評估這些化合物的可能選項(xiàng)。
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