本研究揭示了銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）中轉(zhuǎn)錄因子RccR（PA5438）在調(diào)控碳代謝及氨基糖苷類抗生素耐受性中的重要作用。銅綠假單胞菌是一種革蘭氏陰性機(jī)會性致病菌，常導(dǎo)致人類嚴(yán)重感染，尤其在囊性纖維化患者中。氨基糖苷類抗生素如妥布霉素、慶大霉素等是治療PA感染的關(guān)鍵藥物，但PA已發(fā)展出多種耐藥機(jī)制，包括生物膜形成、靶標(biāo)修飾等。
研究PA的代謝調(diào)控與抗生素耐受性之間的聯(lián)系對于開發(fā)新的抗菌策略至關(guān)重要。研究人員通過CRISPR/Cas12k引導(dǎo)的轉(zhuǎn)座酶技術(shù)構(gòu)建了PA的轉(zhuǎn)錄因子突變文庫，并篩選出rccR基因突變株在妥布霉素選擇下顯著富集，表明rccR的缺失顯著增強(qiáng)了細(xì)菌對氨基糖苷類抗生素的耐受性。轉(zhuǎn)錄組分析顯示，RccR可調(diào)節(jié)丙酮酸代謝（aceE/F）和乙二酸旁路途徑（aceA和glcB）中代謝酶的表達(dá)，進(jìn)而影響對氨基糖苷類抗生素的耐受性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，2-酮-3-脫氧-6-磷酸葡萄糖酸（KDPG）是直接與RccR結(jié)合的信號分子。RccR/KDPG復(fù)合物的結(jié)構(gòu)分析揭示了它們之間的詳細(xì)相互作用。關(guān)鍵殘基R152、K270或R277被丙氨酸替代后，RccR喪失了對KDPG的感應(yīng)能力，并且在以甘油或葡萄糖為唯一碳源時細(xì)菌生長受損。本研究不僅闡明了RccR在PA碳代謝和氨基糖苷類抗生素耐受性中的關(guān)鍵作用，還揭示了KDPG感應(yīng)機(jī)制，為開發(fā)針對PA感染的新抗菌策略提供了重要依據(jù)。通過深入了解RccR介導(dǎo)的代謝調(diào)控機(jī)制，未來有望找到新的靶點(diǎn)，以克服PA的抗生素耐受性，提高臨床治療效果。
Bioscreen全自動生長曲線分析儀的應(yīng)用
Bioscreen C生長曲線分析儀在研究中被用于監(jiān)測不同結(jié)核分枝桿菌菌株的體外生長情況。首先將處于對數(shù)生長中期（OD600nm≈0.6）的各菌株制備成菌懸液。將調(diào)整至相似密度的菌懸液（約200μl）加入Bioscreen C專用的100孔蜂窩板中。Bioscreen C生長曲線分析在37°C下進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)持續(xù)兩周。本研究使用Bioscreen C來比較野生型H37Rv、Rv1272c敲除株（H37RvΔRv1272c）和回補(bǔ)株（H37Rv(ΔRv1272c+Rv1272c)）在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下的生長曲線。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
鑒定出RccR是一個與氨基糖苷類抗生素耐受性相關(guān)的TF，并在銅綠假單胞菌中調(diào)控丙酮酸代謝和乙醛酸分流途徑，揭示了碳代謝、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和藥物耐受性之間的聯(lián)系。確定了RccR/KDPG復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，闡明了KDPG感應(yīng)和RccR介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控的分子機(jī)制。本研究闡明了RccR在PA碳代謝和氨基糖苷類抗生素耐受性中的關(guān)鍵作用，還揭示了KDPG感應(yīng)機(jī)制，為開發(fā)針對PA感染的新抗菌策略提供了重要依據(jù)。通過深入了解RccR介導(dǎo)的代謝調(diào)控機(jī)制。
圖1、rccRrccR缺失突變株對妥布霉素耐受。(A)每個基因的富集分?jǐn)?shù)被排序并繪制。PA5438(rccRrccR)在妥布霉素處理后富集并以藍(lán)色標(biāo)記。(B)散點(diǎn)圖顯示了妥布霉素處理和對照樣品中所有靶位點(diǎn)的插入計數(shù)。屬于PA5438的位點(diǎn)以紅色標(biāo)記。(C)rccRrccR缺失突變體的點(diǎn)種測定。菌株在存在或不存在妥布霉素的LB瓊脂平板上生長。(D)rccRrccR缺失突變體的生長曲線測定。菌株在存在或不存在妥布霉素的LB培養(yǎng)基中生長。數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)(n=3)。
圖2、RccR是丙酮酸代謝和乙醛酸分流途徑的調(diào)節(jié)因子。PAO1野生型和ΔrccR缺失突變體在對數(shù)期(A)和穩(wěn)定期(B)基因表達(dá)顯著性差異分析的火山圖。紅色圓圈表示表達(dá)上調(diào)，藍(lán)色圓圈表示表達(dá)下調(diào)，灰色圓圈表示無顯著差異。(C)野生型PAO1和ΔrccR缺失突變體在對數(shù)期和穩(wěn)定期aceE,aceF,aceAaceE,aceF,aceA和glcBglcB的相對mRNA轉(zhuǎn)錄水平。PAO1的gyrBgyrB基因用作參考基因。數(shù)據(jù)表示為平均值±SD(n=3)。(D)丙酮酸代謝和乙醛酸分流途徑中受RccR調(diào)控的基因。(E)過表達(dá)aceAaceA或glcBglcB基因的PAO1菌株的生長曲線測定。菌株在存在或不存在妥布霉素的LB培養(yǎng)基中生長。
圖3、評估KDPG對RccR的影響。(A)RccR與KDPG結(jié)合的ITC測定。Kd，解離常數(shù)；N，每個RccR的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。在不存在(B)或存在(C)0.0625,0.125,0.25,0.5,1,2,4和8 mM KDPG的情況下，RccR與其操縱子DNA相互作用的EMSA分析。
圖4、RccR/KDPG復(fù)合物的結(jié)構(gòu)表征。(A)RccR/KDPG復(fù)合物四聚體形式的整體結(jié)構(gòu)以及KDPG電子密度的詳細(xì)視圖。單體(A–D)分別用小麥色、淺藍(lán)色、藍(lán)綠色和灰色標(biāo)記。KDPG為綠色。(B)RccR單體結(jié)構(gòu)的卡通圖。α-螺旋、β-折疊和環(huán)分別用青色、洋紅色和粉紅色著色。(C)基于RccR/KDPG三級結(jié)構(gòu)的RccR拓?fù)涫疽鈭D。(D,E)RccR與KDPG之間詳細(xì)的直接氫鍵相互作用。虛線代表直接氫鍵。位于同一單體的殘基用相同顏色標(biāo)記。
圖5、RccR對KDPG的識別對于調(diào)控活性至關(guān)重要。(A)在不存在或存在遞增濃度KDPG的情況下，不同RccR單突變體蛋白與不同DNA結(jié)合能力的EMSA分析。WT，野生型。(B)KDPG與不同RccR單突變體蛋白之間結(jié)合親和力的ITC測定。Ka，結(jié)合常數(shù)；N/A，ITC未檢測到結(jié)合。(C)PAO1 WT和rccR突變株在補(bǔ)充有葡萄糖、甘油或乙酸鹽作為唯一碳源的MOPS基本培養(yǎng)基中的生長曲線。WT，野生型。數(shù)據(jù)表示為平均值±SD(n=3)。(D)以葡萄糖、甘油或乙酸鹽作為唯一碳源時銅綠假單胞菌的碳代謝。
總結(jié)
銅綠假單胞菌擁有復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)，能夠協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝狀態(tài)以快速適應(yīng)變化的環(huán)境。其在精細(xì)調(diào)控代謝狀態(tài)方面的非凡能力使其成功耐受抗生素并逃避宿主免疫防御。然而，銅綠假單胞菌中轉(zhuǎn)錄調(diào)控、代謝狀態(tài)和抗生素耐受性之間的聯(lián)系仍largely不清楚。通過篩選由CRISPR/Cas12k引導(dǎo)的轉(zhuǎn)座酶構(gòu)建的銅綠假單胞菌TF突變體文庫，我們鑒定出rccR(PA5438)是氨基糖苷類抗生素耐受性的一個主要遺傳決定因子，其缺失顯著增強(qiáng)了細(xì)菌耐受性。本研究進(jìn)一步揭示了RccR在丙酮酸代謝(aceE/aceF)和乙醛酸分流途徑(aceA和glcB)中的抑制作用，并且aceA或glcB的過表達(dá)增強(qiáng)了細(xì)菌耐受性。此外鑒定出2-酮-3-脫氧-6-磷酸葡萄糖酸是直接結(jié)合RccR的信號分子。RccR/KDPG復(fù)合物的結(jié)構(gòu)分析揭示了詳細(xì)的相互作用。將關(guān)鍵殘基R152、K270或R277替換為丙氨酸會廢除RccR對KDPG的感知，并損害細(xì)菌在以甘油或葡萄糖為唯一碳源時的生長。
本研究揭示了銅綠假單胞菌中氨基糖苷類抗生素耐受性與RccR介導(dǎo)的中心碳代謝調(diào)控之間的聯(lián)系，并闡明了RccR感知KDPG的機(jī)制。Bioscreen是一種自動化微生物生長曲線分析系統(tǒng)，用于測量不同銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）菌株的生長情況，評估特定代謝途徑在細(xì)菌生長中的作用。通過精確測量不同條件下的細(xì)菌生長曲線，幫助研究人員定量分析了RccR在銅綠假單胞菌碳代謝和抗生素耐受性中的調(diào)控作用。該設(shè)備的自動化和高通量特性使得實(shí)驗(yàn)更加高效和準(zhǔn)確，為研究微生物代謝和抗生素耐受性提供了有力的工具。
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