不同方法對活體原核群落表征準確性的評估本研究通過以總DNA提取為對照，確定土壤中活體原核生物的多度和多樣性，對不同方法所表征土壤原核生物多度和多樣性的準確性進行評估。采用這種方法是因為模擬群落主要由活菌組成，滅菌土壤中的胞外DNA與所添加的胞內DNA相比近乎可以忽略，因此可以認為總DNA提取近似反映了活體原核生物群落。
研究發(fā)現(xiàn)，DNase預消化和PMA處理均顯著低估了16S rRNA基因拷貝數(shù)（圖5A）。此外，除堿性緩沖液洗滌外，所有方法都會導致活體原核生物群落結構發(fā)生顯著改變（圖5B–D和S11）。例如，PMA處理顯著高估了埃希氏菌屬（Escherichia）的比例，而低估了芽孢桿菌屬（Bacillus）和假單胞菌屬（Pseudomonas）的比例（圖5C）。DNase預消化顯著低估了副球菌屬（Paracoccus）的相對多度，而DNA酶消化和rRNA直接表征都顯著高估了鏈霉菌屬（Streptomyces）的比例。進一步分析表明，堿性緩沖液洗滌的群落結構解析準確率最高（94.9%），顯著優(yōu)于DNase預消化（87.8%）、PMA處理（85.1%）及rRNA直接表征（82.2%）（圖5D）。此外，本研究還探討了各個方法所表征原核生物群落與總群落的相似性與環(huán)境因子的關系，這用于反映不同方法的準確性。例如，PMA處理所表征的相似性與土壤總鉀含量呈正相關，與砂粒含量呈負相關；rRNA直接表征的相似性與G+/G-比率（革蘭氏陽性菌/革蘭氏陰性菌）呈正相關，與黏粒含量呈負相關。另外，堿性緩沖液洗滌表征的相似性與土壤pH值呈負相關（圖S12）。
圖5.不同核酸提取方法所表征的模擬微生物類群的多度和群落結構（A）土壤16S rRNA基因拷貝數(shù)；（B）模擬土壤微生物群落的結構；（C）總微生物和活體微生物類群的相對多度差異，差異通過t檢驗揭示；（D）總DNA提取和不同土壤活體微生物研究方法所表征模擬群落結構的相似性。Total：總DNA提?。籇Nase：DNase預消化；ABW：堿性緩沖液洗滌；PMA：疊氮溴化丙錠（PMA）處理；rRNA：rRNA直接表征。
不同方法對土壤胞外DNA的去除效率所有胞內DNA提取方法都能去除土壤中80%以上的游離標簽胞外DNA，但去除效率差異很大（圖6和表S4）。其中，DNase預消化法的去除效率最高，在森林土壤和草地土壤中分別達到99.45%（SD=0.33%，CV=0.33%）和99.86%（SD=0.08%，CV=0.08%）。在森林和草地土壤中，PMA處理的平均去除率也分別達到了91.69%（SD=10.12%，CV=11.04%）和88.04%（SD=19.23%，CV=23.51%），但森林土壤重復間的變異性較大。在所有評估方法中，堿性緩沖液洗滌法的去除率最低，在森林土壤和草地土壤中的去除率分別為85.84%（SD=8.80%，CV=10.24%）和81.94%（SD=9.23%，CV=11.44%）。
圖6.基于不同核酸提取方法的標簽胞外DNA拷貝數(shù)和去除效率（A）森林生態(tài)系統(tǒng)中不同核酸提取方法下標簽胞外DNA的拷貝數(shù)；（B）森林生態(tài)系統(tǒng)中不同核酸提取方法下標簽胞外DNA的去除率；（C）草原生態(tài)系統(tǒng)中不同核試驗提取方法下標簽胞外DNA的拷貝數(shù)；（D）草原生態(tài)系統(tǒng)中不同核酸提取方法下標簽胞外DNA的去除率。Total：總DNA提取；DNase：DNase預消化；ABW：堿性緩沖液洗滌；PMA：疊氮溴化丙錠（PMA）處理。
方法
研究地點與土壤采樣
土壤樣本采集自中國西部的52個地點，涵蓋云南、四川、西藏、青海和新疆等多個省份（圖S13）。研究區(qū)域包括多種生態(tài)系統(tǒng)類型，如高寒草甸、高寒草原、沙漠、灌木叢、杉木林、針葉林和農田（表S5）。研究區(qū)域的氣候和地形也具有高度異質性，采樣點的海拔、年均溫（MAT）和年均降水量（MAP）分別為421~4618 m、-6.04~21.83℃和40.7~1565.1 mm。這種高度異質性確保了本研究結果的普適性。此外，大部分研究地點的氣候干燥和寒冷，凸顯了胞外DNA在影響土壤活體原核生物群落分析中的重要性。
在每個研究地點，記錄了包括生態(tài)系統(tǒng)類型、優(yōu)勢植物、地理坐標、海拔和坡度在內的基本信息，并拍攝了采樣點周圍環(huán)境的照片。隨后，隨機選擇5個子采樣點，最小間隔距離為10 m。采集每個點0~10 cm的土壤樣本，充分混合后，通過2 mm篩網(wǎng)。用于總DNA和胞內DNA提取，以及無機氮、水分含量測定的土壤樣本保存在4℃的冰箱中。用于RNA提取的土壤則保存在液氮中。此外，另一份子樣本風干后用于測定pH值及總有機碳、總氮、總磷、總鉀和有效磷的含量。每個采樣點的MAT和MAP數(shù)據(jù)來自WorldClim數(shù)據(jù)庫。土壤類型基于聯(lián)合國糧農組織和維也納國際應用系統(tǒng)分析研究所建立的世界土壤數(shù)據(jù)庫HWSD2.0提取。
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