主要分析了水分活度與藥品微生物控制的相關(guān)問(wèn)題，涉及水分活度概念與發(fā)展歷程，以及水分活度與微生物控制的關(guān)系和原理、應(yīng)用現(xiàn)狀和應(yīng)用前景等內(nèi)容，探討了水分活度在藥品微生物控制方面的應(yīng)用趨勢(shì)，為水分活度測(cè)定在我國(guó)非無(wú)菌制劑微生物控制中的應(yīng)用和２０２０年版《中國(guó)藥典》相關(guān)內(nèi)容的修訂提供參考。
水分活度（ａｗ）是評(píng)價(jià)食品和化妝品微生物風(fēng)險(xiǎn)和產(chǎn)品穩(wěn)定性的重要依據(jù)，但在制藥工業(yè)中使用水分含量反映藥品質(zhì)量安全和穩(wěn)定還是一個(gè)相對(duì)較新的概念。ａｗ與微生物的生長(zhǎng)密切相關(guān)，而微生物指標(biāo)是反映藥品安全性和有效性的重要指標(biāo)，通過(guò)測(cè)定ａｗ可更好地反映藥品質(zhì)量。
２０１５年版《中國(guó)藥典》整合了先進(jìn)理念，借鑒了國(guó)外藥典的先進(jìn)技術(shù)和經(jīng)驗(yàn)，兼顧國(guó)情對(duì)非無(wú)菌制劑微生物限度檢查法等內(nèi)容做了較大修訂，但在非無(wú)菌制劑微生物控制相關(guān)指導(dǎo)原則方面還不完善，僅收載了水分測(cè)定方法，尚未收載ａｗ測(cè)定在非無(wú)菌制劑中的應(yīng)用指導(dǎo)原則，仍與《美國(guó)藥典》（ＵＳＰ）存在一定差距，這一現(xiàn)狀與我國(guó)《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》（ＧＭＰ）強(qiáng)調(diào)的藥品源頭控制和過(guò)程控制要求不相適應(yīng)。因此，亟需制訂相應(yīng)的指導(dǎo)原則，以提高藥品微生物污染的源頭控制和過(guò)程控制的可操作性和有效性。
１概述
１９５３年，澳大利亞食品微生物學(xué)家Ｓｃｏｔｔ研究了３０℃下金黃葡萄球菌與ａｗ的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)其生長(zhǎng)有最低的ａｗ限值，低于該值微生物就不能生長(zhǎng)，首次提出了ａｗ的概念。隨后，Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ等[８]研究沙門菌的生長(zhǎng)與ａｗ的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)了類似規(guī)律。１９５７年，Ｓｃｏｔｔ對(duì)引起食品腐敗的微生物與ａｗ的關(guān)系進(jìn)行了全面論述，發(fā)現(xiàn)是ａｗ而不是水分含量決定微生物賴以生存的自由水的多少。之后，ａｗ與微生物的關(guān)系便成為微生物科學(xué)家研究的熱門領(lǐng)域。
１９７８年，德國(guó)食品微生物學(xué)家Ｌ．Ｌｅｉｓｔｎｅｒ研究了影響微生物生長(zhǎng)的各種因素，提出了柵欄理論，認(rèn)為ａｗ是影響微生物生長(zhǎng)的重要柵欄因子之一，ａｗ與其他柵欄因子協(xié)同作用，應(yīng)用于食品的保存。２００６年，ＵＳＰ２９-ＮＦ２４＜１１１２＞首次收載ａｗ測(cè)定應(yīng)用于非無(wú)菌制劑微生物控制的章節(jié)，將其成功引入制藥工業(yè)藥品微生物控制。ａｗ是相同溫度下產(chǎn)品水蒸氣壓（Ｐ）與純水蒸氣壓（Ｐｏ）的比值。其在數(shù)值上等于封閉系統(tǒng)中由產(chǎn)品產(chǎn)生的相對(duì)濕度（ＲＨ）的１／１００。ＲＨ可通過(guò)直接測(cè)量蒸氣分壓或露點(diǎn)的方法獲得，也可通過(guò)傳感器間接測(cè)量。ａｗ和平衡相對(duì)濕度（ＥＲＨ）的計(jì)算關(guān)系為ＥＲＨ（％）＝ａｗ×１００％。
２水分活度與微生物控制原理２．１微生物生長(zhǎng)的最低ａｗ
微生物需要自由水進(jìn)行新陳代謝活動(dòng)，如細(xì)菌細(xì)胞只能通過(guò)細(xì)胞壁傳遞營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物，代謝產(chǎn)物必須是可溶形式以滲透細(xì)胞壁。當(dāng)微生物細(xì)胞處于低ａｗ時(shí)，由于滲透作用，水傾向于流出細(xì)胞，如果細(xì)胞無(wú)法調(diào)節(jié)水的平衡，細(xì)胞生長(zhǎng)將會(huì)被抑制甚至死亡。而ａｗ是“自由水”的量度，因此用于反映微生物的生長(zhǎng)繁殖，ａｗ是比水分含量更有效的參數(shù)。微生物的生長(zhǎng)活動(dòng)只發(fā)生在一定ａｗ范圍內(nèi)，其生長(zhǎng)都有最低限值，低于了這個(gè)限值微生物就不能生長(zhǎng)。不同微生物生長(zhǎng)的最低ａｗ需求不同。
一般來(lái)說(shuō)，革蘭陰性菌包括與藥品質(zhì)量密切相關(guān)的控制菌，如銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、沙門菌等在ａｗ低于０．９１的產(chǎn)品中不會(huì)生長(zhǎng)繁殖，革蘭陽(yáng)性菌如金黃色葡萄球菌在ａｗ低于０．８６不會(huì)生長(zhǎng)繁殖，黑曲霉在ａｗ０．７７以下不會(huì)生長(zhǎng)繁殖，所有微生物在ａｗ低于０．６０時(shí)不會(huì)增殖。產(chǎn)品中的ａｗ降低意味著微生物可利用的自由水減少，微生物的新陳代謝困難。
許多微生物通過(guò)細(xì)胞調(diào)節(jié)可在低ａｗ條件下存活，但不能生長(zhǎng)。隨著ａｗ的降低將導(dǎo)致微生物生長(zhǎng)停滯期的延長(zhǎng)，生長(zhǎng)速率減慢和菌落數(shù)量減少，圖１顯示了不同ａｗ對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)曲線和最大菌落數(shù)量的影響。產(chǎn)品中細(xì)菌、酵母菌和霉菌的萌發(fā)、新陳代謝、繁殖和生存需要可利用水，基于這樣的規(guī)律，可利用ａｗ這一重要參數(shù)預(yù)測(cè)產(chǎn)品中潛在微生物生長(zhǎng)繁殖的能力和潛在的安全風(fēng)險(xiǎn)。
２．２ａｗ是微生物生長(zhǎng)的柵欄因子
ａｗ的研究源于食品，在食品中的應(yīng)用也較為成熟。柵欄技術(shù)認(rèn)為ａｗ是諸多影響微生物生長(zhǎng)的重要柵欄因子之一。柵欄技術(shù)把高溫、低溫、控制ａｗ、調(diào)節(jié)ｐＨ、采用輻照、控制氧化-還原電位、添加抑菌劑等歸納成單獨(dú)柵欄因子，并提出食品防腐就是調(diào)控這些因子，打破微生物內(nèi)平衡，從而限制微生物的生長(zhǎng)繁殖。這些因子相互作用形成了特殊的防止食品腐敗變質(zhì)的柵欄，對(duì)食品的防腐保持聯(lián)合作用及柵欄效應(yīng)。
柵欄因子間的相互作用及與食品中微生物的相互作用的結(jié)果，不僅是這些因子單獨(dú)效應(yīng)的簡(jiǎn)單累加，而且也是協(xié)同作用，這種效應(yīng)稱作柵欄效應(yīng)（ｈｕｒｄｌｅｅｆｆｅｃｔ）?？刂疲幔?，對(duì)于中等含水量和高含水量食品保藏具有重大意義。在食品儲(chǔ)藏中，初始載荷微生物應(yīng)當(dāng)不能克服最初的柵欄因子，否則食品就會(huì)腐敗變質(zhì)，甚至引發(fā)食物中毒。
通過(guò)柵欄技術(shù)使食品本身具有一定的抑菌能力，可以使食品的微生物特性穩(wěn)定，使得儲(chǔ)藏的食品更安全。柵欄技術(shù)應(yīng)用于食品保存的６個(gè)案例（圖２）可幫助理解ａｗ對(duì)于微生物生長(zhǎng)的重要意義。柵欄因子的組合將增加不利于食品中潛在微生物的生長(zhǎng)，并增加微生物生長(zhǎng)的滯后期，如果微生物的生存環(huán)境持續(xù)抑制其生長(zhǎng)繁殖，滯后期無(wú)限延長(zhǎng)，將致使微生物死亡。
３ａｗ在藥品微生物控制中的應(yīng)用現(xiàn)狀
相比藥品，食品中富含豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，更適合微生物的生長(zhǎng)繁殖，ａｗ在食品工業(yè)中的成功應(yīng)用，為非無(wú)菌制劑的微生物控制提供了值得借鑒的新方法。ＵＳＰ＜１１１２＞中提到的“水分活度的測(cè)定在非無(wú)菌制劑中的應(yīng)用”，為非無(wú)菌制劑的微生物控制提供了一個(gè)有力的應(yīng)用指導(dǎo)原則。相比微生物限度檢查，ａｗ測(cè)定可以更快、更準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)微生物對(duì)產(chǎn)品穩(wěn)定性和安全性的影響。
同時(shí)，ａｗ也和產(chǎn)品的化學(xué)和物理穩(wěn)定性有直接關(guān)系。通過(guò)對(duì)藥品ａｗ的測(cè)定和分析，不但可篩選出更合理的處方，同時(shí)還能預(yù)測(cè)藥品潛在的微生物風(fēng)險(xiǎn)。然而，ａｗ測(cè)定在藥品微生物控制中的應(yīng)用還是一個(gè)較新的領(lǐng)域，通過(guò)其可以反映藥品潛在微生物生長(zhǎng)狀況及評(píng)估安全風(fēng)險(xiǎn)，近年來(lái)逐漸受到重視。一些制藥公司已利用ａｗ控制微生物生長(zhǎng)的理念開發(fā)新藥，可節(jié)省成本，優(yōu)化微生物限度檢查方案。如美國(guó)輝瑞制藥有限公司應(yīng)用ａｗ預(yù)測(cè)生產(chǎn)過(guò)程中溶液中微生物的生長(zhǎng)或抑制，創(chuàng)建溶液類型，以確定溶液的有效期，節(jié)省時(shí)間-費(fèi)用成本
葛蘭素史克公司在新藥開發(fā)時(shí)，將ａｗ作為穩(wěn)定性計(jì)劃的一部分進(jìn)行測(cè)試，以確保包裝產(chǎn)品在特定儲(chǔ)存溫度和濕度下的質(zhì)量穩(wěn)定，滿足安全性標(biāo)準(zhǔn)和有效期要求，為研發(fā)和商業(yè)應(yīng)用提供優(yōu)化的微生物限度檢查和抑菌效力檢查測(cè)試計(jì)劃節(jié)省大量資源和成本，提高了效率。目前，制藥企業(yè)存在對(duì)藥品過(guò)度防護(hù)和依賴終端檢驗(yàn)的情況，微生物污染風(fēng)險(xiǎn)管理水平較薄弱，過(guò)程控制手段缺失。ａｗ是影響微生物生長(zhǎng)的關(guān)鍵因素，影響著藥品的安全性和有效性，對(duì)其測(cè)定是進(jìn)行藥品生產(chǎn)的過(guò)程控制和參數(shù)放行的必要手段，值得深入研究和應(yīng)用。
４ａｗ在藥品微生物控制中的應(yīng)用前景
在制藥工業(yè)中，非無(wú)菌制劑ａｗ與以下方面有關(guān)：１）藥品處方及抑菌體系的抑菌有效性；２）藥品處方中易于化學(xué)水解的活性藥物成分的降解；３）藥品處方（尤其是液體、膏、乳液和霜）易受微生物污染的程度；4）提供了減少微生物限度檢查，依照通則非無(wú)菌制劑微生物限度檢查法篩查藥品有效性、穩(wěn)定性和控制菌釋放的理論依據(jù)。不同ａｗ藥品中的微生物生存行為對(duì)于藥品微生物控制非常重要，低ａｗ會(huì)防止微生物在藥品上的生長(zhǎng)繁殖。
在科學(xué)的微生物風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估基礎(chǔ)上，可根據(jù)ａｗ設(shè)置有針對(duì)性的個(gè)性化微生物控制方案，如全面的微生物限度檢查或減少日常檢查。應(yīng)注意的是，使用ａｗ進(jìn)行微生物控制，必須遵循嚴(yán)格的ＧＭＰ，以確保微生物的最低負(fù)荷。ＵＳＰ＜１１１２＞提供了藥品處方對(duì)微生物污染影響的指導(dǎo)，降低藥品ａｗ對(duì)預(yù)防潛在微生物的增殖大有裨益；非無(wú)菌制劑的處方，生產(chǎn)步驟和測(cè)試應(yīng)反映這一參數(shù)。當(dāng)前符合ＧＭＰ生產(chǎn)要求的藥品ａｗ較低，沒(méi)有或幾乎沒(méi)有微生物污染的風(fēng)險(xiǎn)，在此情況下，日常進(jìn)行的微生物限度檢查沒(méi)有必要。
由于非水性液體制劑或固體藥劑為低ａｗ，不支持孢子萌發(fā)和微生物生長(zhǎng)，其微生物監(jiān)控頻率決定于產(chǎn)品的歷史測(cè)試數(shù)據(jù)和原料、水、生產(chǎn)過(guò)程的微生物污染控制的有效性證明。在科學(xué)的微生物風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估基礎(chǔ)上，采用ａｗ測(cè)定進(jìn)行微生物監(jiān)控，建立合理的微生物控制策略、設(shè)計(jì)性能優(yōu)良的藥品對(duì)于節(jié)約成本、提高效率、提升產(chǎn)品質(zhì)量具有重要指導(dǎo)意義。國(guó)際人用藥品標(biāo)準(zhǔn)協(xié)調(diào)組織（ＩＣＨ）Ｑ６Ａ的決策樹６＃原料藥和輔料的微生物檢查（圖３）和８＃非無(wú)菌藥品的微生物檢查（圖４），是低ａｗ的非無(wú)菌原料藥和輔料及非無(wú)菌制劑可不進(jìn)行批批微生物限度檢查的重要技術(shù)指導(dǎo)原則。我國(guó)于２０１７年正式加入ＩＣＨ，意味著中國(guó)的藥品監(jiān)管部門、制藥行業(yè)和研發(fā)機(jī)構(gòu)將逐步轉(zhuǎn)化和實(shí)施國(guó)際科學(xué)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)和指南，并積極參與規(guī)則制訂，將推動(dòng)國(guó)際創(chuàng)新藥品早日進(jìn)入中國(guó)市場(chǎng)，滿足臨床用藥需求，同時(shí)提升國(guó)內(nèi)制藥產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新能力和國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)力。
在新形勢(shì)下研究國(guó)外藥品微生物控制方面的先進(jìn)經(jīng)驗(yàn)，對(duì)于優(yōu)化產(chǎn)業(yè)升級(jí)、節(jié)約資源及逐步提高我國(guó)藥品的國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)力具有現(xiàn)實(shí)意義。應(yīng)用ａｗ控制藥品生產(chǎn)過(guò)程的微生物生長(zhǎng)是微生物控制發(fā)展的必然趨勢(shì)。應(yīng)重視ａｗ在藥品研發(fā)階段參與處方篩選，評(píng)估藥品的微生物風(fēng)險(xiǎn)，設(shè)計(jì)出低微生物風(fēng)險(xiǎn)的藥品，不是依賴檢驗(yàn)進(jìn)行藥品的微生物控制，而是質(zhì)量源于設(shè)計(jì)（ＱｂＤ）理念的必然要求。然而，我國(guó)藥品領(lǐng)域尚未建立ａｗ測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)方法，利用ａｗ控制微生物生長(zhǎng)的應(yīng)用仍為空白。因此，亟待制訂符合國(guó)情和發(fā)展需要的非無(wú)菌制劑ａｗ的測(cè)定應(yīng)用指導(dǎo)原則，以推動(dòng)我國(guó)藥品微生物控制的發(fā)展。
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