長期共培養(yǎng)實驗
長期實驗中使用的NAS（新谷葉-Page改良Neff氏阿米巴鹽水）培養(yǎng)基制備如下：將1克谷草粉（Aldon Corp.,Avon,NY）在1升去離子水中煮沸5分鐘，然后通過玻璃纖維濾膜（GF/C,Whatman）過濾。冷卻后，加入5毫升PAS儲備溶液II和I，并用去離子水將最終體積恢復至1升。
實驗前，將生物體分開培養(yǎng)并準備如下。對于細菌培養(yǎng)，將粘質(zhì)沙雷氏菌菌株Db11的單個菌落接種到帶膜濾器蓋（corning）的聚碳酸酯錐形瓶中的80毫升NAS培養(yǎng)基中。將錐形瓶在25°C、120 rpm的旋轉(zhuǎn)搖床上培養(yǎng)48小時。
收集阿米巴和纖毛蟲細胞，用40毫升PAS（Page氏阿米巴鹽水）離心（1200 x g，15分鐘）洗滌兩次。離心后，將細胞重懸于PAS中，并調(diào)整至最終濃度約為10個細胞/μL。
為了制備噬菌體儲備液，從半融合平板上收集LB-軟瓊脂（0.7%），與LB培養(yǎng)基混合（每板4毫升），并在37°C下培養(yǎng)3.5小時。通過離心（9682 x g，5°C，20分鐘）去除碎片。使用0.2μm Acrodisc®注射器過濾器（Pall）過濾儲備液。將噬菌體儲備液在NAS培養(yǎng)基中稀釋1:100,000，得到約10^9 PFU/mL。
長期實驗在帶有0.2μm疏水濾膜蓋（Sarstedt TC 83.1810.002）的25 cm2聚苯乙烯培養(yǎng)瓶中啟動。根據(jù)群落組成，每個培養(yǎng)瓶接種1毫升相應的微生物，并用NAS培養(yǎng)基將總體積調(diào)整至15毫升。共有五種群落組成處理：（1）細菌；（2）細菌+纖毛蟲；（3）細菌+阿米巴；（4）細菌+噬菌體；以及（5）細菌+所有三種敵害。每個處理重復36個培養(yǎng)瓶。
靜態(tài)液體培養(yǎng)物在25°C下培養(yǎng)。每7天，徹底混合每個培養(yǎng)瓶的內(nèi)容物，并用新鮮的NAS培養(yǎng)基更換50%的體積，使系統(tǒng)成為脈沖資源類型。在每次更新之前，從每個處理中隨機選擇四個培養(yǎng)瓶進行破壞性取樣。
細菌生物量和原生動物種群大小的測量
從每個培養(yǎng)瓶的五個獨立的400μL樣品中測量自由水相的細菌生物量，使用蜂窩板2（Oy Growth Curves Ab Ltd Helsinki,Finland）。使用Bioscreen C®分光光度計（Oy Growth Curves Ab Ltd）在460-580 nm波長下測量光密度（OD）作為生物量。測量以5分鐘為間隔重復10次。
為了測量附著在壁上的粘質(zhì)沙雷氏菌生物膜的量，將15毫升的1%結(jié)晶紫溶液（Sigma-Aldrich St.Louis,Missouri,USA）注入培養(yǎng)瓶。10分鐘后，用蒸餾水沖洗培養(yǎng)瓶三次，然后加入15毫升96%乙醇，將結(jié)晶紫從壁上溶解24小時。如上所述，通過結(jié)晶紫-乙醇溶液的吸光度量化形成的生物膜量。使用Bioscreen C分光光度計在460-580 nm波長下測量結(jié)晶紫-乙醇溶液的OD來量化形成的生物膜量。
噬菌體種群密度可以通過例如流式細胞術測量。然而，系統(tǒng)中噬菌體顆粒的總數(shù)并不是一個有意義的度量，因為噬菌體豐度并不能說明噬菌體對系統(tǒng)中存在的細菌基因型（或表型）的感染性。但是，我們通過從每個培養(yǎng)瓶取三個獨立的500μL樣品，確認了噬菌體在整個實驗過程中存在于微觀世界中。為了去除宿主細菌、阿米巴和纖毛蟲，用氯仿處理樣品，并以17,000 x g離心7分鐘。然后將10微升上清液點滴到含有與200μL過夜生長的祖先Db11細胞混合的0.7%LB-瓊脂上層的1.5%瓊脂平板上，并將平板在25°C下培養(yǎng)過夜。整個實驗過程中所有培養(yǎng)瓶的所有樣品都在細菌菌苔上形成了噬菌斑，證實了噬菌體在實驗期間沒有滅絕。
為了跟蹤阿米巴的種群動態(tài)，小心地將培養(yǎng)瓶倒置，使用奧林巴斯SZX顯微鏡（Olympus Optical Co.,Ltd.Tokyo,Japan）（32倍放大）在暗場模式下從微觀世界底壁數(shù)字化八個隨機放置的圖像（總面積18 mm2）。使用我們實驗室為Image Pro Plus軟件（v.7.0）開發(fā)的腳本計數(shù)每個圖像中的細胞數(shù)。
為了確定纖毛蟲密度，將250μL開放水樣品與10μL盧戈氏溶液混合，然后注入玻璃比色皿（深度2.34 mm）中，以便纖毛蟲細胞可以立即染色和固定。對于每個樣品，使用奧林巴斯SZX顯微鏡（32倍放大）數(shù)字化八個隨機放置的圖像（總面積18 mm2）。使用Image Pro Plus腳本計數(shù)每個圖像中的細胞數(shù)。
用噬菌體Semad11和細菌Db11進行的短期實驗
將Db11在25°C的LB平板上培養(yǎng)48小時，將單個菌落接種到NAS培養(yǎng)基中。液體培養(yǎng)物在搖床（120 rpm）中于25°C培養(yǎng)48小時。將5微升細菌培養(yǎng)物接種到含有400μL NAS培養(yǎng)基的蜂窩板2（Oy Growth Curves Ab Ltd）的200個孔中。同時，向100個孔中加入5微升含有約10^4 PFU的噬菌體儲備液（溶于dH2O中）。使用Bioscreen C分光光度計（Oy Growth Curves Ab Ltd）在460-580 nm波長下測量OD。測量以5分鐘為間隔重復進行100小時。在測量結(jié)束時，從噬菌體處理的孔中確認了具有感染性的Semad11（使用祖先Db11）的存在。
統(tǒng)計分析
除了細菌的開放水和壁生物量以及原生動物密度外，我們還計算了開放水與生物膜生物量的比率以及系統(tǒng)中的總細菌生物量。這些響應變量在每周的取樣中測量，每次取樣為每個處理選擇四個培養(yǎng)瓶進行破壞性取樣。因此，我們使用ANOVA，其中時間和群落組合被視為因素（響應變量=群落+時間+群落x時間+誤差）。需要時，對響應變量進行平方根或?qū)?shù)轉(zhuǎn)換以滿足分析假設。
使用Friedman檢驗和Wilcoxon符號秩檢驗比較不同細菌敵害和敵害組合在減少開放水和生物膜中細菌生物量方面的效率（樣本量在所有比較中均為4）。
表1.Wilcoxon符號秩檢驗顯示不同敵害組合在減少生物膜和開放水中細菌生長方面的效率。
所有分析均使用SPSS v.19（IBM New York,NY,USA.）完成。
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