摘要胞外DNA在土壤中的長期留存已得到充分證實，但其對微生物多度與多樣性分析的干擾卻仍存爭議。這一爭議可能主要源于有關現(xiàn)有活體微生物研究方法可靠性的認知局限。本研究基于在中國西部地區(qū)所采集的土壤樣品，系統(tǒng)比較了堿性緩沖液洗滌、疊氮溴化丙錠（PMA）處理、DNase預消化和rRNA直接表征等4種常用方法在表征土壤活體原核生物群落方面的表現(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn)：胞外DNA的去除顯著影響了原核生物多度、多樣性、群落結構和共現(xiàn)網絡的解析，但對群落構建機制解析的影響近乎可以忽略。不同研究方法所表現(xiàn)出的影響卻同樣顯著差異：相比于基于總DNA的研究，DNase預消化與PMA處理顯著降低了原核生物多度，基于堿性緩沖液洗滌與rRNA直接表征法的分析則未觀察到顯著差異；DNase預消化顯著降低了物種豐富度，rRNA直接表征法則增加了原核生物豐富度。盡管67.8%的擴增子序列變體（ASVs）為共有類群，但基于不同方法所表征的各微生物類群的相對多度存在顯著差異。此外，胞外DNA去除降低了共現(xiàn)網絡的復雜性，卻增強了網絡的魯棒性。DNase預消化展現(xiàn)出最高的DNA去除效率與活體微生物表征準確性，而其他方法卻存在去除效率低、結果穩(wěn)定性差或相關結果解釋的不確定性高等問題。本研究表明不同方法所表征的活體原核生物群落存在顯著差異，推薦使用DNase預消化法進行土壤活體原核群落研究，這為優(yōu)化微生物組研究方法提供了重要指導。
引言
土壤微生物作為生物地球化學循環(huán)的核心驅動者，在維持生態(tài)系統(tǒng)功能與健康中發(fā)揮關鍵作用。當前的研究主要依賴于擴增子測序、宏基因組分析、基因芯片和定量PCR等技術。值得注意的是，源于裂解微生物的細胞外DNA可在土壤中持續(xù)存在數(shù)周至數(shù)年，占土壤總DNA庫的近40%。其存在的時間受溫度、濕度、pH和有機質等環(huán)境因子調控：低溫與高有機質含量能夠延緩降解，而高溫高濕的環(huán)境則會加速分解。然而現(xiàn)行微生物分析多基于總DNA提取，其結果可能受胞外DNA的干擾。因此，消除胞外DNA的潛在影響成為當前土壤微生物組學研究的重要挑戰(zhàn)。為應對這一挑戰(zhàn)，研究人員開發(fā)了一系列方法來研究活體微生物，包括堿性緩沖液洗滌、疊氮溴化丙錠（PMA）處理、DNase預消化和rRNA直接表征等。其中堿性洗滌能有效去除胞外DNA，曾是研究活體微生物最常用的方法。
PMA在可見光下與胞外DNA形成不可逆的共價交聯(lián)，從而抑制后續(xù)PCR擴增，而活體細胞憑借完整膜結構可排斥PMA進入，使其DNA得以提取和擴增，近年來PMA處理法在研究土壤活體微生物多度和多樣性方面得到了廣泛應用。DNase I作為去除胞外DNA的另一種有效方法，主要通過水解磷酸二酯鍵降解胞外DNA，也常被用于土壤活體微生物組研究。此外，因rRNA在胞內含量高，且在環(huán)境中極不穩(wěn)定，已有學者提出，rRNA表征法也可用于研究活體微生物群落?？傊?，這些方法原理迥異，可能對活體微生物群落解析產生顯著有影響。
事實上，關于胞外DNA對微生物多樣性分析的影響，不同方法的研究結論存在矛盾。例如，基于PMA處理的多項研究都觀察到胞外DNA顯著影響了土壤微生物多樣性。相比之下，一項基于DNase預消化法的研究則未觀察到胞外DNA對土壤細菌多樣性的顯著影響。因此，比較和評估解析土壤活體微生物的常用方法是土壤微生物學領域的迫切需要。目前，已有一些研究初步評估了相關方法在研究土壤活體微生物多度和多樣性方面的效率。然而，相關研究主要集中于基于純培養(yǎng)菌株或針對有限數(shù)量環(huán)境樣本的單一方法。
目前，尚未有基于大尺度環(huán)境樣本對土壤活體微生物研究方法進行系統(tǒng)的比較和評估。因此，本研究基于在中國西部采集的土壤樣本，系統(tǒng)地比較和評估了研究活體微生物群落的堿性緩沖液洗滌法、PMA處理法、DNase預消化法和rRNA直接表征法等4種常用方法。樣點的海拔、年均溫和年均降水量范圍分別為21~4618 m、-6.04~21.83℃和40.7~1565.1 mm。測定并比較了基于不同方法所表征土壤原核生物的多度、多樣性、共現(xiàn)模式和群落構建機制。
此外，還通過標簽DNA添加實驗評估了各方法的胞外DNA去除效率，并采用模擬群落驗證了各方法在表征活體群落方面的可靠性。本研究重點驗證了“不同方法在表征活體原核生物多度與多樣性方面存在顯著差異”這一核心假設。
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