3討論
當(dāng)前，應(yīng)用于水稻白葉枯病防治的化學(xué)藥劑存在種類(lèi)少、對(duì)環(huán)境影響大且因長(zhǎng)期使用而導(dǎo)致功效不足等問(wèn)題，因此尋找安全高效的新型抗菌劑以防治水稻細(xì)菌病害是當(dāng)前的迫切需求。噬菌體是一種能夠特異性裂解細(xì)菌的病毒，能夠有效防治多種病原菌，且不會(huì)對(duì)其他有益微生物群落造成影響，被視為理想抗菌劑之一。如今隨著研究的深入，噬菌體在醫(yī)療、農(nóng)業(yè)、食品等領(lǐng)域的細(xì)菌防治中扮演了越來(lái)越重要的角色。
本文從稻蝦田水中分離得到一株能夠裂解水稻黃單胞菌的噬菌體vB_XaS_HDB2。用于生物防治的噬菌體必須遺傳背景清晰，且不攜帶耐藥和毒力基因，否則可能造成耐藥和毒力基因在細(xì)菌間水平轉(zhuǎn)移。裂解模塊直接參與細(xì)菌裂解，HDB2裂解模塊中具有3個(gè)ORF 21、22、23，分別被注釋為穿孔素(holin)、裂解酶(lysin)和膜融合蛋白(spanin)。噬菌體介導(dǎo)的革蘭氏陽(yáng)性菌裂解通常由穿孔素—裂解酶系統(tǒng)參與;裂解酶是噬菌體在復(fù)制后期表達(dá)的一類(lèi)水解酶，作用于細(xì)胞壁肽聚糖，導(dǎo)致細(xì)胞壁破裂從而釋放子代噬菌體;穿孔素是一種跨膜蛋白，能夠在細(xì)胞膜中形成非特異性的跨膜通道，以便釋放細(xì)胞內(nèi)的裂解酶。膜融合蛋白是裂解革蘭氏陰性菌所需的第3種蛋白。革蘭氏陰性菌因其外膜保護(hù)肽聚糖層，對(duì)噬菌體裂解酶具有天然的抗性，因此還需要膜融合蛋白介導(dǎo)產(chǎn)生橫跨內(nèi)、外膜的通道，幫助子代噬菌體釋放。裂解酶因其能特異性消滅細(xì)菌且不易產(chǎn)生抗性、裂解譜較寬廣等特點(diǎn)同樣引起了研究人員的注意，成為了當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。將來(lái)我們可以進(jìn)一步嘗試對(duì)噬菌體HDB2的裂解酶進(jìn)行過(guò)表達(dá)，探究其殺菌能力。
HDB2不含毒力基因和抗生素耐藥基因，表明該噬菌體在基因水平上具有較好的安全性，可以用于細(xì)菌的防治。同時(shí)，HDB2含有一個(gè)tRNA基因，對(duì)于噬菌體編碼的tRNA的作用，暫時(shí)還未有明確的解釋?zhuān)壳白顝V泛接受的假設(shè)是密碼子補(bǔ)償，即宿主很少使用但噬菌體必需的密碼子是由噬菌體編碼的tRNA補(bǔ)充的。而近年來(lái)Yang等提出的“噬菌體tRNA代表了一種抵消宿主tRNA耗竭的手段”說(shuō)法也獲得了部分人支持，該觀點(diǎn)認(rèn)為通過(guò)下調(diào)噬菌體tRNA的表達(dá)，修改tRNA使其無(wú)法用于翻譯等使噬菌體tRNA可以作為一種機(jī)制來(lái)抵消噬菌體感染期間反密碼子核酸酶對(duì)tRNA的消耗，從而使噬菌體能夠翻譯其蛋白質(zhì)并成功完成感染周期。有研究分析了烈性噬菌體與溶源噬菌體之間的差異，發(fā)現(xiàn)烈性噬菌體含有更多的tRNA，推測(cè)tRNA可能有助于噬菌體獲取更高的裂解性。此外還有關(guān)于噬菌體tRNA有助于在感染期間維持生長(zhǎng)或擴(kuò)大噬菌體的宿主范圍等假設(shè)。在本團(tuán)隊(duì)的烈性噬菌體資源庫(kù)中，噬菌體vB_BceS_LY1、vB_VpaP_DE10、vB_VpP_DE17、vB_VpaP_FE11、vB_VpP_ AC2均未預(yù)測(cè)到tRNA基因，vB_VpP_BA6被預(yù)測(cè)含有3個(gè)tRNA基因、vB_VpS_CA8和vB_ VpS_BA3含有1個(gè)tRNA，關(guān)于噬菌體tRNA的功能作用，還有待進(jìn)一步研究。
本試驗(yàn)將噬菌體與宿主菌共培養(yǎng)，初步探究了噬菌體HDB2在體外試驗(yàn)中對(duì)宿主菌的抑菌效果，為噬菌體應(yīng)用提供了參考。結(jié)果顯示，添加的噬菌體數(shù)量越多即MOI越高，抑菌效果越明顯。值得注意的是將噬菌體與宿主菌共培養(yǎng)的48 h內(nèi)，出現(xiàn)了細(xì)菌濃度先降低后升高的現(xiàn)象，推測(cè)這是因?yàn)閯傞_(kāi)始噬菌體大量裂解細(xì)菌導(dǎo)致菌液濃度降低，但后續(xù)由于噬菌體抗性菌的出現(xiàn)，細(xì)菌再度增長(zhǎng)。噬菌體和它們的宿主細(xì)菌會(huì)不斷的共同進(jìn)化，在此過(guò)程中，細(xì)菌主要以3種方式逃避噬菌體感染。第1種是受體適應(yīng)，噬菌體感染成功的關(guān)鍵是噬菌體與細(xì)菌表面受體特異性結(jié)合，細(xì)菌通過(guò)隨機(jī)突變或者水平基因轉(zhuǎn)移，使得受體變異，噬菌體無(wú)法吸附，從而抵擋住噬菌體感染。第2種是宿主防御系統(tǒng)保護(hù)，細(xì)菌在被噬菌體侵染過(guò)程中進(jìn)化出各種免疫系統(tǒng)來(lái)抵御噬菌體感染。目前已知最廣泛的防御系統(tǒng)是細(xì)菌限制修飾(restriction modification，RM)系統(tǒng)，RM系統(tǒng)作為免疫系統(tǒng)攻擊進(jìn)入細(xì)胞的噬菌體DNA，從而使這些DNA被限制性?xún)?nèi)切酶水解，而細(xì)菌自身的DNA在甲基化酶的作用下被保護(hù)起來(lái)，使得細(xì)菌不會(huì)受到傷害。此外還有CRISPR-Cas系統(tǒng)、流產(chǎn)感染(abortive infection，Abi)系統(tǒng)等。第3類(lèi)是噬菌體衍生防御系統(tǒng)。如Sie系統(tǒng)，這是噬菌體進(jìn)入宿主后為細(xì)菌提供的防御系統(tǒng)，目的在于防止細(xì)菌被相同或密切相關(guān)的噬菌體再次感染。噬菌體抗性菌的產(chǎn)生使其抑制細(xì)菌的效果大大被削弱，這是噬菌體防治細(xì)菌感染需要解決的主要問(wèn)題之一。針對(duì)這一問(wèn)題，研究學(xué)者們提出了噬菌體雞尾酒療法，噬菌體—抗生素聯(lián)合應(yīng)用，使用基因工程改造噬菌體以及利用噬菌體裂解酶療法等新的策略來(lái)應(yīng)對(duì)。使用不同組合的噬菌體雞尾酒除能夠擴(kuò)大宿主譜、增強(qiáng)殺菌性能外，還可以有效抑制或延緩噬菌體耐藥性的出現(xiàn)。Yoo等利用噬菌體抗性細(xì)菌分離得到的4株噬菌體構(gòu)建了3種噬菌體雞尾酒，它們對(duì)多重耐藥肺炎克雷伯菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制能力。值得注意的是，有些已經(jīng)對(duì)噬菌體產(chǎn)生抗性的細(xì)菌菌株，在加入噬菌體雞尾酒后，對(duì)雞尾酒中其他噬菌體產(chǎn)生抗性后，可以對(duì)原來(lái)的噬菌體重新敏感。此外，研究人員認(rèn)為，噬菌體耐藥性的出現(xiàn)可能會(huì)影響細(xì)菌對(duì)抗生素的敏感性，使得細(xì)菌對(duì)抗生素重新敏感。他們推測(cè)是因?yàn)槭删w在侵染細(xì)菌過(guò)程中可能依賴(lài)于細(xì)胞膜蛋白或其他表面結(jié)構(gòu)，而在某些情況下，這些結(jié)構(gòu)也與細(xì)菌的抗生素耐藥性密切相關(guān)。因此，先單獨(dú)使用噬菌體進(jìn)行治療，在產(chǎn)生噬菌體抗性后再轉(zhuǎn)向使用抗生素也是對(duì)抗噬菌體抗性的對(duì)策之一。
4結(jié)論
本文分離得到的黃單胞菌噬菌體vB_XaS_HDB2耐受性強(qiáng)，對(duì)紫外線較敏感，不含毒力基因和耐藥基因，安全性較高。MOI大于0.1時(shí)，HDB2對(duì)黃單胞菌有較好的抑制效果，具有作為新型抗菌劑防治水稻白葉枯病的潛力，可為噬菌體進(jìn)一步研究與應(yīng)用提供理論依據(jù)。
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