實(shí)時(shí)定量PCR分析在7,500實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)（Applied Biosystems）上進(jìn)行。每個(gè)反應(yīng)在包含以下組分的反應(yīng)混合物中進(jìn)行：1x濃縮的商業(yè)緩沖液（隨聚合酶提供，Metabion）、0.625 U Taq聚合酶（Metabion）、4 mM MgCl?、30,000倍稀釋的SYBR Green（Sigma）、5% DMSO、0.5 ng/μl乙?；疊SA（Sigma）、0.8%甘油（ROTH）、400μM dNTP混合物（Metabion）、前向和后向特異性引物（各400μM）、cDNA模板和水，最終體積為25μl。反應(yīng)進(jìn)行初始變性步驟（95°C 3分鐘），隨后進(jìn)行45個(gè)循環(huán)的變性（95°C 15秒）和引物退火-延伸（60°C 1分鐘）。
每個(gè)循環(huán)的退火-延伸步驟讀取熒光。循環(huán)后，在60至95°C范圍內(nèi)以0.33°C的增量進(jìn)行熔解溫度分析。在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中，自動(dòng)調(diào)整背景范圍，并手動(dòng)調(diào)整Ct評估的閾值。對于每個(gè)cDNA樣品，使用三種模板量進(jìn)行六次反應(yīng)，每種重復(fù)兩次。對于每個(gè)研究的基因，單獨(dú)選擇cDNA量（如果可能，所有基因相同）以獲得在14至34個(gè)循環(huán)范圍內(nèi)的Ct值。基于三個(gè)cDNA量之間的預(yù)期Ct差異以及產(chǎn)物熔解曲線評估結(jié)果質(zhì)量。在計(jì)算中省略罕見的異常結(jié)果。通過使用乳酸乳球菌參考基因tuf和purM（分別編碼延伸因子TU和磷酸核糖氨基咪唑合成酶）對結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。使用Primer Express軟件（Applied Biosystems）設(shè)計(jì)每個(gè)基因的特異性引物（表1）。在使用前，驗(yàn)證引物的PCR反應(yīng)效率相等。將所得數(shù)據(jù)從qPCR循環(huán)儀程序?qū)С龅奈募M(jìn)行處理，并導(dǎo)入Excel表格中以便于計(jì)算靶基因與參考基因之間的表達(dá)比率。這些比率通過△Ct方法計(jì)算，在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中分別使用參考基因Ct的幾何平均值。
碳源利用的表型測試 通過生長測試和發(fā)酵模式分析研究突變細(xì)胞與親本菌株相比的表型變化。
生長測試在Microbiology Reader Analyser, Bioscreen C (Labsystems)上進(jìn)行，使用0.2 ml補(bǔ)充有所需糖的CDM。在長達(dá)100小時(shí)的生長過程中，每30分鐘記錄一次細(xì)菌培養(yǎng)物OD600的變化。
使用API 50CH測試（按照制造商的說明（BioMérieux））測定49種糖的發(fā)酵模式，并在30°C有氧或厭氧條件下培養(yǎng)12、24和36小時(shí)后記錄。
通過表型微陣列系統(tǒng)（Biolog，USA）根據(jù)制造商的說明進(jìn)一步全局測量代謝譜。將乳酸乳球菌菌株劃線在含有G-M17瓊脂的平板上。從平板上刮下菌落，并滴定到IF-0a接種液（Biolog）中，添加生長補(bǔ)充劑和Biolog氧化還原四唑鎓染料，直到溶液達(dá)到所需的透光度，根據(jù)Biolog為鏈球菌物種推薦的標(biāo)準(zhǔn)方案。將100微升等分試樣添加到碳源板（PM1和PM2）的每個(gè)孔中。將板在30°C下在有氧OmniLog培養(yǎng)箱板閱讀器中培養(yǎng)，并通過測定四唑鎓染料的比色還原動(dòng)力學(xué)測量代謝活性。表型微陣列使用Biolog的氧化還原測定法，利用細(xì)胞呼吸或發(fā)酵作為通用報(bào)告基因，并提供表型的精確量化。如果孔中的表型強(qiáng)烈"陽性"，則細(xì)胞代謝活躍，還原四唑鎓染料并形成強(qiáng)烈的顏色。如果它們的代謝活性減慢或停止，則形成較少的顏色或不形成顏色。數(shù)據(jù)在大約72小時(shí)內(nèi)每10分鐘收集一次。這段時(shí)間足以使陽性對照孔中顯色，而陰性對照孔保持無色。使用Biolog動(dòng)力學(xué)和參數(shù)軟件分析數(shù)據(jù)。PM1和PM2 Biolog測定評估細(xì)菌利用測定中使用的190種碳化合物中任何一種作為唯一碳源的能力。
結(jié)果
包含claR基因的DNA區(qū)域的結(jié)構(gòu)特征 圖1描繪了來自乳酸乳球菌IL1403的claR基因（原yebF）的染色體區(qū)域。ClaR顯示出與RpiR家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的高度序列相似性：它是一種雙結(jié)構(gòu)域蛋白，具有67個(gè)殘基的N端DNA結(jié)合螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋（HTH）基序和123個(gè)殘基的C端糖異構(gòu)酶（SIS）結(jié)構(gòu)域（圖1a；http://pfam.sanger.ac.uk/）。
claR上游是yebE基因，編碼一種假設(shè)蛋白。在這兩個(gè)基因之間的基因間區(qū)域內(nèi)，定位了一個(gè)推定rho非依賴型終止子，其自由能值（dG）為-15 kcal/mol（圖1b，c）。為了驗(yàn)證其功能性，將該終止子克隆到pGBT58載體中，位于啟動(dòng)子和編碼兒茶酚2,3-雙加氧酶的xylE基因之間。在攜帶該構(gòu)建體的大腸桿菌菌株中，獲得的兒茶酚2,3-雙加氧酶活性水平達(dá)到0.50±0.04 U，低于觀察到的對照值（不含yebE終止子的pGBT58）1.25±0.16 U。因此，與攜帶野生型pGBT58載體的菌株相比，yebE終止子的存在導(dǎo)致兒茶酚加氧酶活性降低60%。
根據(jù)計(jì)算機(jī)分析，claR基因前面至少有兩個(gè)推定啟動(dòng)子（圖1b，c），表明存在多個(gè)潛在的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。鑒定出的claR上游潛在-10和-35啟動(dòng)子區(qū)域均未與分別定義為TATAAT和TTGACA的啟動(dòng)子共有序列完全一致。這些潛在啟動(dòng)子之一位于yebE rho非依賴型終止子上游（圖1b，c）。為了驗(yàn)證在claR上游DNA區(qū)域是否存在功能性啟動(dòng)子，將包含上述推定啟動(dòng)子的DNA片段插入到啟動(dòng)子探針pJIM2374載體中的luxAB報(bào)告基因前面，并導(dǎo)入乳酸乳球菌LL302。當(dāng)測試claR上游區(qū)域時(shí)，檢測到顯著的熒光素酶活性，表明其中至少嵌入了一個(gè)功能性啟動(dòng)子。
claR缺失突變體的表型 在我們先前的研究中，利用pGhost9::ISS1對發(fā)酵乳糖的ccpA突變體進(jìn)行隨機(jī)誘變。通過此程序，在補(bǔ)充有X-Gal的平板上，我們分離了幾個(gè)在ccpA突變體背景中具有β-半乳糖苷酶陰性表型的突變體。其中，在ccpA突變體中claR（yebF）的失活導(dǎo)致其喪失乳酸發(fā)酵能力。因此，在本研究中，在IL1403野生型菌株和IL1403△ccpA中均進(jìn)行了claR的缺失，分別產(chǎn)生IL1403△claR和IL1403△ccpA△claR突變體。隨后，測試了IL1403△claR和IL1403△ccpA△claR在補(bǔ)充有各種糖的CDM中的生長，并與它們各自的親本菌株進(jìn)行了比較。在C-CDM中，IL1403△claR突變體最初顯示無生長能力，并且在長時(shí)間培養(yǎng)后觀察到細(xì)胞光密度的微小增加（圖2a）。在IL1403△claR菌株中缺失ccpA導(dǎo)致所得IL1403△ccpA△claR菌株在C-CDM中的生長部分恢復(fù)（圖2a）。與它們的親本IL1403和IL1403△ccpA菌株相比，IL1403△claR和IL1403△ccpA△claR在L-CDM中均無生長（圖2b）。向該培養(yǎng)基中添加誘導(dǎo)濃度的纖維二糖（LC-CDM）并未恢復(fù)突變體的生長（圖2c）。在IL1403和IL1403△ccpA菌株中缺失claR基因?qū)ν蛔凅w在含熊果苷、七葉苷、半乳糖、葡萄糖或水楊苷的培養(yǎng)基中的生長沒有影響（數(shù)據(jù)未顯示）。
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