材料與方法
細菌菌株、培養(yǎng)基和質粒 本研究中使用的細菌菌株和質粒列于表1。大腸桿菌細胞在37°C的Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基中培養(yǎng)，而乳酸乳球菌在M17葡萄糖培養(yǎng)基（G-M17）或化學限定培養(yǎng)基（CDM）中培養(yǎng)，培養(yǎng)基補充有1%葡萄糖（G-CDM）、1%纖維二糖（C-CDM）、1%乳糖（L-CDM）、1%半乳糖（Gal-CDM）、1%熊果苷（A-CDM）、1%半乳糖加1%纖維二糖（GalC-CDM）或1%乳糖與誘導濃度（0.01%）的纖維二糖（LC-CDM）。需要時，向培養(yǎng)基中添加氨芐青霉素（Amp；用于大腸桿菌為100μg ml?1）或紅霉素（Em；用于大腸桿菌為100μg ml?1，用于乳酸乳球菌為5μg ml?1）。固化培養(yǎng)基含有1.5%瓊脂，必要時添加IPTG（異丙基-β-D-硫代半乳糖苷；用于大腸桿菌為1 mM）和X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷；用于大腸桿菌為50μg ml?1）。
claR缺失突變體和互補質粒的構建 通過攜帶與claR基因重疊的DNA片段的pGhost9與包含這些DNA片段的染色體區(qū)域之間的雙交換創(chuàng)建突變體。使用適當?shù)那跋蚝秃笙蛞飳Γū?）擴增重疊的DNA片段。使用引物claRPstI/claRERpr（表1）和ExTaq聚合酶擴增claR上游區(qū)域，并作為PstI/EcoRI片段克隆到pGhost9的相應位點中。使用引物claRERrv/claRSalI（表1）擴增claR下游區(qū)域，并作為EcoRI/SalI片段克隆到攜帶上游片段的載體中，產(chǎn)生pGhost9△claR質粒。將缺失質粒導入乳酸乳球菌IL1403和IL1403△ccpA。通過將攜帶pGhost9△claR的乳酸菌株的過夜培養(yǎng)物在新鮮G-M17-Em培養(yǎng)基中稀釋10?3來強制同源重組。稀釋的培養(yǎng)物在非允許溫度（38°C）下的G-M17中培養(yǎng)2.5小時。在含有紅霉素的G-M17瓊脂平板上于38°C選擇含有pGhost9△claR整合到染色體中的整合子。通過在允許溫度28°C下在無抗生素條件下培養(yǎng)整合子至少100代，從乳酸乳球菌染色體中切除并去除整合載體。通過菌落PCR、對菌株Em敏感性的測定以及對包含缺失的claR基因的DNA區(qū)域進行測序，確認所得claR缺失菌株乳酸乳球菌IL1403△claR的遺傳結構。
為了互補claR缺失，使用引物claRSmaf和claRPstR（表1）擴增帶有其推定啟動子區(qū)域的claR基因，克隆到pGEM-T中，并轉入大腸桿菌TG1。分離所得質粒DNA，用PstI和SmaI消化，連接到用相同限制酶消化的pIL253上，并轉入乳酸乳球菌IL1403△claR，產(chǎn)生IL1403△claRpIL253claR菌株。
克隆和測量yebE基因后推定內(nèi)在終止子的活性 使用引物yebEterf和yebEterr（表1）擴增yebE下游類似于rho非依賴型終止子的DNA序列。按照先前描述的方法，將進一步的克隆程序導入攜帶編碼兒茶酚2,3-雙加氧酶的xylE基因的pGBT58（表1）中，并通過酶促測定測量其表達。其活性在三個獨立實驗中測定。作為參考點，還在野生型pGBT58載體中測量了兒茶酚2,3-雙加氧酶的活性，該載體在xylE基因與其啟動子之間不含終止子。
將推定的claR啟動子區(qū)域克隆到luxAB基因上游 如先前所述，制備由pGEM-T、pJIM2374和包含推定claR啟動子（控制luxAB基因）的非編碼區(qū)域（用yebEterf和yebEterr擴增）組成的構建體。由于pGEM-T在革蘭氏陽性細菌中不能復制，且pJIM2374不包含rep基因，將重組質粒pJIM2374claRp轉入乳酸乳球菌LL302，其染色體中編碼RepA蛋白。通過在對數(shù)生長中期在C-CDM中測量的熒光素酶活性，推斷克隆區(qū)域中存在功能性啟動子。
通過實時定量PCR相對定量基因表達 對于實時定量PCR（RT-qPCR），使用TRI Reagent（Sigma）按照制造商的說明，從25 ml在指數(shù)生長中期（OD600=0.6）收獲的IL1403野生型菌株及其突變體（IL1403△ccpA和IL1403△claR）培養(yǎng)物中分離總RNA。細胞在G-CDM、C-CDM、Gal-CDM、A-CDM或GalC-CDM中生長。從至少三個獨立培養(yǎng)物中提取RNA。
使用High-Capacity cDNA逆轉錄試劑盒（Applied Biosystems）按照制造商的說明，從經(jīng)DNA酶I（Sigma）處理的2μg RNA樣品合成第一鏈cDNA。