摘要 在先前的一系列研究中，我們團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)乳酸乳球菌中存在一種替代的乳糖利用途徑。除了具有P-β-葡萄糖苷酶和P-β-半乳糖苷酶活性的糖水解酶（BglS）外，該途徑還涉及染色體編碼的纖維二糖特異性PTS（PTSCel-Lac）組分，包括PtcA、PtcB和CelB。本報(bào)告顯示，該系統(tǒng)受到ClaR的調(diào)控，ClaR是一種來自RpiR家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的新型激活蛋白。盡管RpiR蛋白在乳酸菌中廣泛分布，但其功能尚未通過功能分析得到證實(shí)。本文中，我們表明ClaR的活性依賴于細(xì)胞內(nèi)纖維二糖-6-磷酸的可用性，而其他糖類如葡萄糖或半乳糖對其沒有影響。我們還表明，在纖維二糖存在下，ClaR對于激活bglS和celB的表達(dá)至關(guān)重要，并對ptcA和ptcB的激活有有限的影響。在測試的190種碳源中，claR的缺失僅降低了乳酸乳球菌在含乳糖和/或纖維二糖的培養(yǎng)基中的生長，表明該調(diào)控因子在糖代謝背景下的特異性較窄。
引言
乳酸菌（LAB），包括乳酸乳球菌，是碳水化合物分解代謝及其調(diào)控領(lǐng)域深入研究的焦點(diǎn)，這些過程在工業(yè)發(fā)酵過程中非常重要。LAB中最普遍的碳水化合物攝取途徑是磷酸烯醇式丙酮酸-磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（PEP-PTS），該系統(tǒng)將糖轉(zhuǎn)運(yùn)與進(jìn)入糖的磷酸化聯(lián)系起來。磷酸烯醇式丙酮酸作為第一個(gè)磷酸基團(tuán)供體給酶I，酶I利用復(fù)雜的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移級聯(lián)反應(yīng)，通過跨膜蛋白EIIC磷酸化進(jìn)入細(xì)菌的糖。在可通過PTS內(nèi)化的多種碳水化合物中，在LAB中，這些系統(tǒng)以高效轉(zhuǎn)運(yùn)乳汁（乳糖）和植物（β-葡萄糖苷）糖類而聞名，這些糖類對于涉及LAB物種的工業(yè)發(fā)酵過程非常重要。
由于乳酸發(fā)酵的經(jīng)濟(jì)重要性，乳酸乳球菌中這種糖的代謝被廣泛研究。這些研究主要關(guān)注兩個(gè)途徑：（i）質(zhì)粒定位的乳糖特異性PTS（PTSLac）和（ii）染色體編碼的乳糖通透酶-β-半乳糖苷酶系統(tǒng)。后一個(gè)系統(tǒng)以非磷酸化形式轉(zhuǎn)運(yùn)乳糖，使其能夠被β-半乳糖苷酶隨后切割。最近，我們報(bào)道了在乳酸乳球菌IL1403中發(fā)現(xiàn)并運(yùn)作的第三種替代乳糖攝取系統(tǒng)。這種新型乳糖利用途徑涉及纖維二糖特異性PTS（PTSCel-Lac）的染色體編碼組分。PTSCel-Lac的蛋白質(zhì)編碼在兩個(gè)不同的區(qū)域，包含ptcA、ptcB（一個(gè)區(qū)域）和celB（第二個(gè)區(qū)域），分別編碼EIIA、EIIB和EIIC。后一個(gè)區(qū)域還包含bglS基因，該基因編碼一種具有P-糖水解活性的酶，兼具P-β-葡萄糖苷酶和P-β-半乳糖苷酶活性。這種BglS酶已被證明在乳酸乳球菌IL1403中促進(jìn)通過PTSCel-Lac內(nèi)化的纖維二糖和乳糖的切割。因此，PtcAB、CelB和BglS在乳酸乳球菌IL1403中形成了一個(gè)針對纖維二糖和乳糖攝取和水解的完整系統(tǒng)。我們推測PTSCel-Lac的存在不僅限于乳酸乳球菌IL1403，可能常見于其他乳酸菌株中。這后來在Solopova等人對乳酸乳球菌MG1363的研究中得到了證實(shí)。在這種細(xì)菌中，替代乳糖代謝途徑，盡管由乳糖或纖維二糖不同地誘導(dǎo)，但依賴于乳酸乳球菌IL1403使用的相同PTSCel-Lac組分。
進(jìn)入糖的轉(zhuǎn)運(yùn)及其后續(xù)代謝的效率受到幾種調(diào)控蛋白的嚴(yán)格控制，這些調(diào)控蛋白形成了必要的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，用于感知環(huán)境條件并設(shè)定細(xì)胞的分解代謝能力。Guédon等人區(qū)分了兩組調(diào)控因子——通用調(diào)控因子和次級調(diào)控因子。這種通用調(diào)控因子的主要例子是分解代謝控制蛋白A（CcpA）。CcpA是一種在許多低GC含量的革蘭氏陽性細(xì)菌中運(yùn)作的保守蛋白，與其輔阻遏物Ser-P-HPr一起，結(jié)合到稱為分解代謝物響應(yīng)元件（cre）的14核苷酸順式作用DNA靶位點(diǎn)，促進(jìn)碳分解代謝激活（CCA）或抑制（CCR）。在乳酸乳球菌菌株中，已顯示CcpA抑制與β-葡萄糖苷、果糖、半乳糖或乳糖攝取相關(guān)的不同基因，同時(shí)激活糖酵解las操縱子。
除了全局調(diào)控因子外，碳分解代謝也可能由屬于不同蛋白質(zhì)家族（如LacI、LysR、AraC、GntR、DeoR、RpiR或BglG）的特定和局部次級調(diào)控因子控制，這些調(diào)控因子在LAB中廣泛分布。已顯示這些家族中的一些調(diào)控因子控制編碼α-半乳糖苷、β-葡萄糖苷、果糖、乳糖、麥芽糖、山梨糖、蔗糖和木糖利用的基因在乳酸球菌中的表達(dá)。
乳酸乳球菌IL1403的YebF蛋白（現(xiàn)指定為纖維二糖-乳糖調(diào)控蛋白—ClaR）屬于RpiR家族的調(diào)控因子。在細(xì)菌基因組中，有許多基因編碼屬于RpiR家族的潛在調(diào)控因子）。然而，迄今為止，尚未有這些基因被證明在LAB的碳水化合物分解代謝中發(fā)揮作用。我們先前曾提出ClaR可能參與激活bglS、celB、ptcA和ptcB基因，這些基因編碼乳酸乳球菌IL1403中新型且唯一的乳糖利用途徑的組分。已經(jīng)證明這些基因的表達(dá)受到通用分解代謝抑制系統(tǒng)的嚴(yán)格調(diào)控，而bglS和celB還需要纖維二糖的存在才能完全誘導(dǎo)。
在本報(bào)告中，我們顯示在乳酸乳球菌IL1403中，編碼PTSCel-Lac組分的基因在纖維二糖存在下通過新型激活因子ClaR進(jìn)行調(diào)控。此外，通過表型微陣列的全局表型分析表明，ClaR是纖維二糖和乳糖代謝不可或缺的特定調(diào)控因子。
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