圖2、Rv1272c和亞油酸通過Treg細(xì)胞促進(jìn)分枝桿菌存活。a，b）指示的Mtb菌株（a）或H37Rv±亞油酸（b）在14天（37°C）內(nèi)的體外生長曲線。c，感染H37Rv或ΔRv1272c菌株的BMDM中的細(xì)胞內(nèi)c.f.u.。d，用H37Rv感染BMDM并用亞油酸或DMSO處理。細(xì)胞內(nèi)c.f.u.在指定時(shí)間內(nèi)測定。例如，C57BL/6小鼠被指定的Mtb菌株（~200 c.f.u.）氣溶膠感染4周。使用流式細(xì)胞術(shù)（FCM）測量CD4+T-bet+（e）、CD8+T-bet+
圖3、Rv1272c和亞油酸增強(qiáng)了Treg細(xì)胞上的CTLA-4表面運(yùn)輸。a-d，在感染H37Rv（a，c）或指示的Mtb菌株（b，d）1 d后，將BMDM與或不與亞油酸處理的CD4+T reg細(xì)胞共孵育1天;ELISA法檢測培養(yǎng)上清液中TGFβ（a，b）和IL-10（c，d）水平。e，f，在感染指定Mtb菌株1 d后，將BMDMs與CD4+Treg細(xì)胞共孵育1 d，用FCM測量CD4+T reg細(xì)胞中總CTLA-4水平（e）和膜CTLA-4水平（f）的MFI。g，在感染后4、8、12、16、20和24天用同種型對(duì)照IgG或抗CTLA-4抗體（每只小鼠500μg）處理的C57BL/6小鼠被氣溶膠感染，每只小鼠約200 c.f.u.指示的Mtb菌株;然后，通過飲用水對(duì)受感染的小鼠進(jìn)行亞油酸或不亞油酸治療。h）在感染后,8,12,16,20和24天用他莫昔芬治療的Ctla4fl/+或Ctla4fl/+Foxp3CreERT2小鼠被氣溶膠感染，每只指定Mtb菌株的小鼠約200c.f.u.，持續(xù)4周。使用c.f.u.測定法測量小鼠肺部的細(xì)菌負(fù)荷。i）在感染指定Mtb菌株1天后，將BMDM與或不與用同種型對(duì)照IgG或抗CLTA-4抗體（40μg ml?1）處理的CD4+T reg細(xì)胞共孵育1天。
圖4、Rv1272c通過CTLA-4介導(dǎo)的ROS抑制來損害巨噬細(xì)胞的抗分枝桿菌能力。a）用DMSO或NAC（ROS抑制劑）預(yù)處理24 h，然后與同種型對(duì)照IgG或抗CTLA-4阻斷抗體（40μg ml?1）處理的Treg細(xì)胞共培養(yǎng)1 d;使用c.f.u.測定法測定指定Mtb菌株在感染2天的BMDM中的細(xì)胞內(nèi)存活率。b）在感染后4、8、12、16、20和24天用DT或PBS處理的C57BL/6或Foxp3DTR小鼠被氣溶膠感染，每只小鼠約200 c.f.u.指示的Mtb菌株，持續(xù)4周。采用FCM法測定肺組織分選的F4/80+巨噬細(xì)胞中ROS水平的MFI。c）用同種型對(duì)照IgG或抗CTLA-4抗體（每只小鼠500μg）處理的C57BL/6小鼠被氣溶膠感染，每只小鼠約200 c.f.u.指示的Mtb菌株，持續(xù)4周。采用FCM法測定肺組織分選的F4/80+巨噬細(xì)胞中ROS水平的MFI。d、在指定Mtb菌株感染1 d后，將BMDM與或不使用亞油酸處理的CD4+Treg細(xì)胞共孵育，或用同種型對(duì)照IgG或抗CLTA-4抗體（40μg ml?1）共孵育1 d;采用FCM檢測BMDMs中ROS水平的MFI。
圖5、亞油酸促進(jìn)Ca2+依賴性CTLA-4表面運(yùn)輸。a，e）在IL-2和TGFβ存在下用抗CD3和抗CD28抗體刺激幼稚CD4+T細(xì)胞3天，并用DMSO或亞油酸（a）和FITC-亞油酸（e）處理。a）使用指示的抑制劑處理CD4+Treg細(xì)胞24 h。采用FCM法測定膜CTLA-4水平的MFI。e）分析了FITC-亞油酸與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的共定位（比例尺，1μm）。右，白線的像素強(qiáng)度圖。b，c）CD4+Treg細(xì)胞用DMSO或亞油酸處理24 h。使用FCM（b）和免疫熒光分析（c;比例尺，1μm）評(píng)估游離細(xì)胞質(zhì)Ca2+。d）在指定Mtb菌株感染1 d后，將BMDMs與亞油酸處理的CD4+Treg細(xì)胞共孵育±1 d;使用FCM評(píng)估Treg細(xì)胞中的游離細(xì)胞質(zhì)鈣。f，g）CD4+Treg細(xì)胞用DMSO或亞油酸處理24 h。使用FCM（f）和免疫熒光分析（g;比例尺，1μm）評(píng)估游離內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣。h）在指定Mtb菌株感染1 d后，將BMDMs與亞油酸處理的CD4+Treg細(xì)胞共孵育±1 d;通過FCM評(píng)估Treg細(xì)胞中的游離ER鈣濃度。i）用FCM檢測thapsigargin（TG）誘導(dǎo)的SOCE在用或不用亞油酸處理的CD4+Treg細(xì)胞中。j，k）CD4+Treg細(xì)胞用DMSO或亞油酸處理24小時(shí)。在FCCP處理（j）和免疫熒光分析（k;比例尺，1μm）下使用FCM評(píng)估Treg細(xì)胞中的游離ER鈣。右，白線的像素強(qiáng)度圖。l）在指定Mtb菌株感染1 d后，將BMDMs與亞油酸或不亞油酸處理的CD4+Treg細(xì)胞共孵育1 d。
總結(jié)
調(diào)節(jié)性T（T reg）細(xì)胞在結(jié)核分枝桿菌（Mtb）感染期間擴(kuò)增并抑制T細(xì)胞介導(dǎo)的對(duì)照。在這里使用全基因組突變體文庫，表明Mtb Rv1272c（一種ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）的表達(dá)在缺氧條件下增加，并通過增加卵磷脂輸入促進(jìn)Mtb在體內(nèi)存活，然后產(chǎn)生和釋放亞油酸。受感染巨噬細(xì)胞釋放的亞油酸通過Ca2?轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ATP2a3促進(jìn)免疫檢查點(diǎn)分子細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗原4（CTLA-4）的表面運(yùn)輸。這反過來又抑制了巨噬細(xì)胞活性氧的產(chǎn)生并促進(jìn)了巨噬細(xì)胞內(nèi)的Mtb存活。
Rv1272c誘導(dǎo)的亞油酸通過增加體內(nèi)Treg細(xì)胞上的CTLA-4表面運(yùn)輸，進(jìn)一步促進(jìn)Mtb免疫逃逸。從機(jī)制上講，亞油酸與Treg細(xì)胞中的ATP2a3相互作用并促進(jìn)線粒體相關(guān)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）膜形成。這促進(jìn)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到線粒體的Ca2+轉(zhuǎn)移和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中Ca2+的消耗，并觸發(fā)儲(chǔ)存作的鈣進(jìn)入，從而提高胞質(zhì)Ca2+水平，以增加Treg細(xì)胞中Ca2+依賴性CTLA-4表面運(yùn)輸。
這些發(fā)現(xiàn)表明，Mtb可以使用代謝物來縱宿主反應(yīng)并促進(jìn)其細(xì)胞內(nèi)存活。Bioscreen C全自動(dòng)微生物生長曲線分析儀在本研究中扮演了“基礎(chǔ)表型驗(yàn)證者”的角色。通過提供精確、自動(dòng)化的體外生長動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)，它有效地排除了Rv1272c基因影響細(xì)菌基本生長的可能性，從而將后續(xù)的研究焦點(diǎn)成功地引導(dǎo)至其真正的功能——即在宿主感染環(huán)境中通過代謝產(chǎn)物亞油酸來調(diào)控免疫反應(yīng)。Bioscreen C允許同時(shí)監(jiān)測多個(gè)菌株的復(fù)孔，提高了實(shí)驗(yàn)效率并確保了條件的一致性。
長達(dá)14天的自動(dòng)監(jiān)測有效捕捉了生長緩慢的分枝桿菌的完整生長周期（遲緩期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期），避免了手動(dòng)測量可能帶來的時(shí)間點(diǎn)遺漏或污染風(fēng)險(xiǎn)。本研究揭示了一條由病原體代謝物驅(qū)動(dòng)的免疫逃避新通路，表明靶向Treg細(xì)胞或CTLA-4可能作為結(jié)核病的潛在免疫治療策略。然而其與一線結(jié)核藥物的協(xié)同效果及安全性仍需在動(dòng)物模型和臨床試驗(yàn)中進(jìn)一步評(píng)估。綜上所述，本研究得出結(jié)論,Mtb通過Rv1272c-亞油酸-ATP2a3-Ca2?-CTLA-4信號(hào)軸，主動(dòng)上調(diào)Treg細(xì)胞的抑制功能，進(jìn)而抑制巨噬細(xì)胞的抗菌活性，最終促進(jìn)其胞內(nèi)寄生生存。這為理解結(jié)核病的免疫病理機(jī)制和開發(fā)新的治療干預(yù)手段提供了重要見解。
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