ET菌株的基因組序列。C.phytofermentans ET菌株基因組相對(duì)于WT菌株含有12個(gè)變異（表2），比具有相似乙醇抗性的C.thermocellum ET基因組（有200至500個(gè)變化）少得多（9）。雖然乙醇抗性可能是一個(gè)復(fù)雜的、多基因性狀，但ET菌株基因組中數(shù)量較少的變化揭示了可能在乙醇耐受性中具有功能作用的DNA變異。12個(gè)突變中有兩個(gè)位于編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的基因中，這些因子可能引起廣泛的基因表達(dá)變化：PolB（DNA指導(dǎo)的RNA聚合酶的β亞基）和一個(gè)LysR調(diào)節(jié)因子Cphy3040。LysR型調(diào)節(jié)因子通常與其靶點(diǎn)共定位于基因組中（28），編碼Cphy3040的基因與編碼NAD依賴性醛脫氫酶的基因相鄰，表明該調(diào)節(jié)因子與醇形成有關(guān)。
乙醇增加細(xì)胞膜的通透性，導(dǎo)致代謝物毒性泄漏出細(xì)胞（29）。因此，乙醇抗性通常涉及膜修飾，例如改變的蛋白質(zhì)含量（8）或更長的鏈脂肪酸和更多的縮醛磷脂（30），以增加膜剛性來減輕乙醇的流體化效應(yīng)。ET菌株在Cphy0233的推定酰基-受體結(jié)合口袋（NCBI登錄號(hào)cd07989）中有一個(gè)D80N變化，Cphy0233是C.butyricum PlsD的同源物，PlsD在磷脂生物合成中將脂肪?；D(zhuǎn)移到甘油-3-磷酸的sn-1位置（31）。Cphy0233突變因此可能通過改變摻入磷脂的脂肪酸來合成更剛性、耐乙醇的細(xì)胞膜。
ET菌株在膜結(jié)合Rnf復(fù)合物的RnfA亞基中有一個(gè)C26S突變，該復(fù)合物耦合H+（32）或Na+（33）外流與電子從還原型鐵氧還蛋白轉(zhuǎn)移到NAD+（34）。產(chǎn)生的電化學(xué)梯度被F0F1 ATP酶利用用于ATP合成。C.phytofermentans Rnf復(fù)合物（Cphy0211至Cphy0216）和F0F1 ATP酶（Cphy3735至Cphy3742）在所有測試的碳源上均高表達(dá)（19），并且可能對(duì)能量保存很重要，類似于C.ljungdahlii（32）。然而，Rnf產(chǎn)生NADH，這可能不能被ET菌株耐受，因?yàn)镋T菌株無法通過AdhE介導(dǎo)的乙醇形成來重新氧化NADH（見下文）。因此，C26S RnfA變體可能使Rnf復(fù)合物功能受損，這犧牲了ATP生產(chǎn)，但可能通過平衡細(xì)胞NADH/NAD+比率而使ET菌株受益。
ET菌株在兩種推定涉及陽離子穩(wěn)態(tài)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中也有突變。Cphy0543與MgtA同源，MgtA是一種P型ATP酶，在低環(huán)境Mg2+濃度下上調(diào)（35），以介導(dǎo)Mg2+攝?。?6）或Ca2+/Mg2+反向轉(zhuǎn)運(yùn)（37）。Cphy3780，一個(gè)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的膜組分（PFAM登錄號(hào)PF06182），似乎與Cphy3780，一種ABC型Na+外排蛋白（NCBI登錄號(hào)cd03267）共轉(zhuǎn)錄。在枯草芽孢桿菌中，這種Na+外排系統(tǒng)被乙醇誘導(dǎo)，并被提議用于補(bǔ)償由于膜屏障減弱導(dǎo)致的細(xì)胞外Na+內(nèi)流（38）。這些陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中的變異可能增加其活性以減輕乙醇脅迫導(dǎo)致的陽離子泄漏。
AdhE活性。ET菌株在Cphy3925 AdhE中有一個(gè)G609D變體，Cphy3925是一種推定的乙醛-CoA脫氫酶和醇脫氫酶（ADH）。G609D突變位于C末端ADH結(jié)構(gòu)域（NCBI登錄號(hào)cd08178）活性位點(diǎn)的保守位置。先前的一項(xiàng)研究報(bào)道了一株乙醇耐受的C.thermocellum菌株，其AdhE突變（P704L和H735R）將輔因子特異性從NADH轉(zhuǎn)變?yōu)镹ADPH，這被提議通過改變內(nèi)部氧化還原平衡來賦予乙醇抗性（9）。為了確定G609D突變對(duì)Cphy3925酶活性的影響，我們純化了WT和ET版本的酶（圖3A），并測試了它們使用NADH或NADPH輔因子體外催化乙酰-CoA轉(zhuǎn)化為乙醇的兩步、雙向反應(yīng)。
突變的Cphy3925失去了NAD（H）依賴性活性，但與C.thermocellum中的突變AdhE不同，G609D突變并未導(dǎo)致NADPH依賴性ADH活性（圖3B至E）。相反，我們的結(jié)果支持ET菌株中止了AdhE介導(dǎo)的乙酰-CoA、乙醛和乙醇的相互轉(zhuǎn)化，這有助于解釋為什么C.phytofermentans ET菌株具有較低的乙醇產(chǎn)量。AdhE功能喪失可能通過降低細(xì)胞內(nèi)乙醇及其高毒性前體乙醛的水平來減輕乙醇脅迫。C.phytofermentans除了Cphy3925外還編碼四個(gè)鐵依賴性ADH以及一個(gè)鋅依賴性ADH。所有6個(gè)ADH均表達(dá)，并且Cphy3925和Cphy1029是在所有測試碳源上表達(dá)量最高的蛋白質(zhì)之一（19,39）。因此，C.phytofermentans可能通過多個(gè)ADH的協(xié)同作用產(chǎn)生乙醇，而這些其他ADH，特別是Cphy1029，負(fù)責(zé)ET菌株產(chǎn)生的乙醇。
乙醇途徑工程。為了增強(qiáng)ET菌株的乙醇生產(chǎn)，將來自Zymomonas mobilis的由丙酮酸脫羧酶（Pdc）和醇脫氫酶（AdhB）組成的替代乙醇生產(chǎn)途徑（圖4A）通過復(fù)制型pQexpE質(zhì)粒（圖4B）轉(zhuǎn)移到C.phytofermentans中。這些酶共同將丙酮酸脫羧與乙醇偶聯(lián)，并氧化NADH，因此代表了AdhE乙醇形成途徑的替代方案。我們選擇表達(dá)外源酶而不是WT拷貝的Cphy3925，因?yàn)锳dhE會(huì)形成多聚體（40），因此突變型AdhE在部分二倍體中可能具有顯性負(fù)效應(yīng)。
pQexpE的表達(dá)使WT和ET菌株的纖維素分解增加了約30%（圖5A），并將乙醇產(chǎn)量相對(duì)于ET菌株提高了70%（P<0.01），從而將乙醇產(chǎn)量恢復(fù)到WT水平（圖5B）。在表達(dá)pQexpE的WT和ET菌株中，CO2產(chǎn)量相對(duì)于H2產(chǎn)量不成比例地增加（表3）。CO2合成升高可能是由于Pdc酶催化的丙酮酸脫羧增加。先前的結(jié)果表明，Pdc/AdhB表達(dá)增強(qiáng)了WT C.cellulolyticum的纖維素分解和乙醇生產(chǎn)，這被提議是由于消耗了過量的丙酮酸，否則會(huì)導(dǎo)致代謝停滯（14）。表達(dá)Pdc/AdhB的C.phytofermentans代謝（纖維素分解以及CO2和乙醇產(chǎn)生）增加可能是由于緩解了過量丙酮酸的抑制?；蛘撸墙徒饷傅谋磉_(dá)或活性可能受NADH水平調(diào)節(jié)，使得Pdc/AdhB對(duì)NADH的再氧化刺激了糖酵解，從而導(dǎo)致底物利用增加。
結(jié)論
在本研究中，我們通過分離、表征和工程化一株乙醇耐受性（ET）的Clostridium phytofermentans菌株，探究了微生物乙醇耐受性的遺傳基礎(chǔ)及表型后果。ET菌株比野生型菌株能在更高的乙醇濃度下生長（圖1），并且能在7%的環(huán)境乙醇濃度下持續(xù)產(chǎn)乙醇（圖2C），但其生長（圖1）和乙醇產(chǎn)量（圖2A）相較于野生型有所受損。ET菌株的基因組測序揭示了涉及代謝多個(gè)方面的基因中存在12個(gè)突變（表2），包括雙功能乙醛CoA/醇脫氫酶AdhE中的一個(gè)G609D變體，該變體使其活性喪失（圖3）。我們通過在pQexpE質(zhì)粒上表達(dá)Zymomonas mobilis的丙酮酸脫羧酶（Pdc）和醇脫氫酶B（AdhB）來補(bǔ)充ET菌株中的AdhE突變（圖4），這促進(jìn)了底物轉(zhuǎn)化（圖5A）并恢復(fù)了乙醇生產(chǎn)（圖5B）。
需要進(jìn)一步的工作來提高C.phytofermentans的植物生物質(zhì)降解和乙醇形成速率及產(chǎn)物濃度。最近，通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)化改善C.phytofermentans在纖維二糖、纖維素和木聚糖上的生長，也獲得了能更快生產(chǎn)乙醇的菌株（41）。本文提出的ET菌株基因組序列暗示了其他可能改善乙醇耐受性和生產(chǎn)的新的潛在方法。例如，我們的結(jié)果表明，關(guān)于乙醇抗性的進(jìn)一步研究應(yīng)側(cè)重于PlsD介導(dǎo)的脂肪酸摻入磷脂、LysR調(diào)節(jié)的基因表達(dá)模式、過表達(dá)Rnf復(fù)合物以刺激AdhE介導(dǎo)的乙醇生產(chǎn)，以及防止陽離子泄漏。
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