一步生長(zhǎng)曲線
通過(guò)一步生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)確定所選噬菌體的裂解量（平均每個(gè)感染細(xì)胞釋放的噬菌體數(shù)量）和潛伏期（從感染到子代噬菌體開(kāi)始釋放的時(shí)間），該方法參考了的描述并略有修改。
圖2噬菌體FSboM-AG3的一步生長(zhǎng)曲線。以博氏志賀氏菌C865為宿主，培養(yǎng)溫度為30℃。
透射電子顯微鏡
用于電子顯微鏡觀察的噬菌體樣品制備如下：使用 Beckman J2-21（Palo Alto, Ca）離心機(jī)和 JA-18.1 固定角轉(zhuǎn)子，將噬菌體在 0.1 M 中性乙酸銨溶液中以 25,000 g 離心 60 分鐘進(jìn)行沉淀。隨后，在相同條件下用 0.1 M 中性乙酸銨溶液洗滌兩次。純化的噬菌體樣品沉積在銅網(wǎng)上的碳涂層 Formvar 薄膜上，用 2% 磷鎢酸鉀（pH 7.0）進(jìn)行負(fù)染，并在操作電壓為 60 kV 的 Philips EM 300 電子顯微鏡下進(jìn)行觀察。使用 T4 噬菌體的尾部作為標(biāo)尺來(lái)監(jiān)控放大倍數(shù)。
DNA 分離和測(cè)序
粗噬菌體裂解液通過(guò) 4°C 下 14,000 x g 離心 20 分鐘去除細(xì)菌碎片。上清液中的污染核酸使用胰 DNase I 和 RNase A（終濃度均為 10μg/mL，Sigma-Aldrich Canada Ltd., Oakville, ON）進(jìn)行消化，然后加入 10% (w/v, 終濃度) PEG-8000 和 1 M NaCl，于 4°C 沉淀噬菌體顆粒過(guò)夜。沉淀的噬菌體顆粒通過(guò)離心回收，重懸于 TM 緩沖液（10 mM Tris-HCl, pH 7.8, 1 mM MgSO4）中，并通過(guò)在自生氯化銫（CsCl）梯度（CsCl 密度 1.5 g/ml，使用 Beckman SW 90Ti 固定角轉(zhuǎn)子，4°C 下 21,000 x g 離心 24 小時(shí)）上進(jìn)行分離來(lái)純化。經(jīng)過(guò)第二次 CsCl 梯度離心（再離心 24 小時(shí)）純化后，使用分子量截留值為 3500 的 Pierce 透析盒（Thermo Scientific, Fisher Scientific, Mississauga, ON），將噬菌體對(duì) 1x 10 mM TE 緩沖液（pH 8.0）透析兩次（每次兩升），并于 4°C 儲(chǔ)存。從部分純化的病毒顆粒中提取 DNA，采用基于的 SDS/蛋白酶 K 方法進(jìn)行修改，隨后用苯酚:氯仿:異戊醇（25:24:1, V/V）抽提，乙醇沉淀，并溶解于 10 mM Tris-HCl（pH 7.5）中。通過(guò)分光光度法對(duì) DNA 進(jìn)行表征。
該 DNA 在麥吉爾大學(xué)和基因組魁北克創(chuàng)新中心（蒙特利爾，QC，加拿大）進(jìn)行了覆蓋度為 19x 的焦磷酸測(cè)序（454 技術(shù)）。
基因組注釋
在注釋之前，將基因組在 rIIA 基因的上游立即打開(kāi)，以便與相關(guān)的 ViI 噬菌體序列進(jìn)行比較?；蚪M首先使用 AutoFACT進(jìn)行自動(dòng)注釋，隨后使用 Kodon version 2.0 (Applied Maths Inc., Austin, TX, USA) 確認(rèn)所有開(kāi)放閱讀框（ORFs）。從預(yù)測(cè)的編碼序列中鑒定基因的依據(jù)是：存在 ATG、GTG、CTG 或 TTG 起始密碼子，后跟至少 30 個(gè)額外密碼子，以及上游序列與核糖體結(jié)合位點(diǎn) GGAGGT 相似。使用默認(rèn)參數(shù)，通過(guò) tRNAScan-SE 和 Aragorn 鑒定噬菌體編碼的 tRNA 基因。
在 http://pfam.sanger.ac.uk/search#searchBatchBlock 進(jìn)行了批量 PFAM 基序搜索，而使用 http://greengene.uml.edu/programs/FindMW.html 確定蛋白質(zhì)分子量和等電點(diǎn)。
使用 BLASTP 算法確定與美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心[NCBI]數(shù)據(jù)庫(kù)中已描述蛋白質(zhì)的相似性，搜索使用 Batch BLAST (http://greengene.uml.edu/programs/NCBI_Blast.html) 進(jìn)行。使用 DNAMAN 確定噬菌體 SboM-AG3 及其宿主鮑氏志賀氏菌的密碼子使用信息。啟動(dòng)子的鑒定基于與共識(shí)大腸桿菌啟動(dòng)子 TTGACA(N15-18)TATAAT 的序列相似性，該序列位于注釋基因的上游。通過(guò)使用 MFOLD檢查與 polyT 序列相鄰的 DNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)來(lái)發(fā)現(xiàn) ρ-非依賴性終止子。此外，我們還使用了 http://pallab.serc.iisc.ernet.in/gester/rungester.html 的 WebGeSTer。僅報(bào)告 ΔG 小于 -10 kcal/mol 的終止子。使用 CoreGenes在蛋白質(zhì)組水平進(jìn)行基因組比較。使用 TMHMM v2.0 和 Phobius預(yù)測(cè)跨膜結(jié)構(gòu)域。
蛋白質(zhì)組分析
使用 Laemmli 樣品緩沖液（4% SDS, 20% 甘油, 10% 2-巰基乙醇, 0.004% 溴酚藍(lán), 0.125 M Tris HCl）裂解完整的噬菌體顆粒，并煮沸 5 分鐘。隨后，溶解的蛋白質(zhì)通過(guò) 12.5% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離，并使用 SimplyBlue SafeStain（Invitrogen Canada, Burlington, ON）染色。使用 BioNumerics 軟件（Applied Maths）分析凝膠數(shù)據(jù)。六個(gè)最強(qiáng)烈的噬菌體條帶被切下，并在女王大學(xué)（安大略省金斯頓，加拿大）的質(zhì)譜設(shè)施中進(jìn)行質(zhì)譜分析。
基因組序列
志賀氏菌噬菌體 SboM-AG3 的注釋基因組序列已存入 NCBI 核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào)為 FJ373894。
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