評(píng)估抗真菌化合物PTS對(duì)黃曲霉的有效性
制備含PTS的培養(yǎng)基
在評(píng)估PTS抗真菌化合物時(shí)，培養(yǎng)基如上所述制備。水用甘油修改至所需aw水平（0.995和0.95）。完全冷卻至室溫（25°C）后，在無(wú)菌條件下添加適量PTS儲(chǔ)備溶液以獲得18種不同濃度。之后，培養(yǎng)基使用多通道移液器倒入100孔微孔板。
平行實(shí)驗(yàn)在9厘米平皿中進(jìn)行，使用含2%w/v瓊脂的固體瓊脂培養(yǎng)基。在這種情況下，為減少實(shí)驗(yàn)長(zhǎng)度，僅制備九種濃度加對(duì)照。當(dāng)培養(yǎng)基約40°C時(shí)，添加適量PTS儲(chǔ)備溶液。熔融培養(yǎng)基劇烈搖動(dòng)后倒入9厘米平皿。
在兩種情況下，通過(guò)添加適當(dāng)體積的80%乙醇（EtOH）水溶液（v/v）進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)，含所有PTS加標(biāo)培養(yǎng)基，給出培養(yǎng)基中最終EtOH濃度0.5%（v/v）。
實(shí)驗(yàn)技術(shù)和數(shù)據(jù)收集
制備不同aw水平的半固體YES培養(yǎng)基（0.125%瓊脂）儲(chǔ)備。完全冷卻后，20毫升培養(yǎng)基無(wú)菌轉(zhuǎn)移至無(wú)菌螺旋蓋塑料容器。添加先前制備的不同PTS在80%乙醇水溶液工作標(biāo)準(zhǔn)適量至每個(gè)塑料容器，以獲得18種不同濃度范圍5至100 ppm，內(nèi)容物搖動(dòng)。
含PTS的培養(yǎng)基接種200μl含1x10^5孢子/毫升的黃曲霉孢子懸浮液?；旌衔飺u動(dòng)后倒入無(wú)菌平皿，然后使用多通道移液器轉(zhuǎn)移至100孔板。每孔加載300μl，每種濃度使用五個(gè)重復(fù)孔。不含接種物但含目標(biāo)乙醇量的培養(yǎng)基作為空白，一旦接種后用作對(duì)照。板加載到Bioscreen C中，培養(yǎng)7天，O.D.在600納米自動(dòng)每20分鐘記錄。
使用原始數(shù)據(jù)生成O.D./時(shí)間圖，使用Microsoft®Excel®和Sigma Plot v.10.0（Systat Software Inc.，豪恩斯洛，倫敦，英國(guó)）。
MIC、NIC和MIC50%（MIC50）計(jì)算
LPM（Lambert&Pearson，2000）（方程（1））使用非線性回歸擬合，最小化平方和作為搜索標(biāo)準(zhǔn)。分析使用JMP統(tǒng)計(jì)軟件包（SAS Institute，卡里，NC，美國(guó)）進(jìn)行。MIC和NIC分別使用方程（2）和（3）計(jì)算。MIC50使用方程（4）計(jì)算。該方程通過(guò)解濃度（x）在方程（1）中當(dāng)P0=（P0/2）時(shí)獲得。
該值的優(yōu)勢(shì)在于它考慮了劑量響應(yīng)（斜率參數(shù)），而其他僅基于MIC的測(cè)量則沒(méi)有。
使用菌絲菌落延伸計(jì)算LD50和LD90
使用含1.0x10^6孢子/毫升的孢子懸浮液在0.05%Tween 80鹽溶液中，在無(wú)菌條件下接種平皿中心。菌絲延伸速率測(cè)量超過(guò)7天。生長(zhǎng)滯后期視為達(dá)到5毫米直徑菌落的時(shí)間（天）。每種處理制備五個(gè)平皿，菌落直徑在培養(yǎng)期間在兩個(gè)垂直方向測(cè)量。兩個(gè)直徑之和除以4獲得半徑。這些半徑測(cè)量然后平均超過(guò)使用的重復(fù)數(shù)。使用Baranyi生長(zhǎng)模型（Baranyi等人，1993；Baranyi&Roberts，1994）分析數(shù)據(jù)，最小化滯后期（λ，小時(shí)）和最大比生長(zhǎng)速率（μm，毫米/天）計(jì)算的主觀性。計(jì)算LD50和LD90值以比較生長(zhǎng)速率與對(duì)照處理。
結(jié)果
培養(yǎng)基瓊脂含量?jī)?yōu)化
當(dāng)使用固體培養(yǎng)基（0.5-2%瓊脂w/v）時(shí)，表面接種和針接種孢子懸浮液到培養(yǎng)基中導(dǎo)致真菌生長(zhǎng)。然而，從Bioscreen獲得的O.D.時(shí)間^-1曲線給出高變異性。重復(fù)孔之間和不同重復(fù)實(shí)驗(yàn)之間的變異性高（數(shù)據(jù)未顯示）。液體培養(yǎng)基提供良好生長(zhǎng)產(chǎn)量和較少變異性，但重復(fù)孔和重復(fù)實(shí)驗(yàn)之間仍有顯著差異。
最佳結(jié)果使用半固體培養(yǎng)基獲得。使用的瓊脂含量范圍從0.1%到0.2%瓊脂w/v。圖2顯示在YES培養(yǎng)基中含0.125%和0.2%瓊脂w/v的十個(gè)重復(fù)孔生長(zhǎng)黃曲霉菌落從孢子接種物的結(jié)果。這表明當(dāng)使用較低瓊脂濃度時(shí)，孔間重現(xiàn)性更好。因此，選擇0.125%w/v瓊脂作為最佳選項(xiàng)。不同日期的重復(fù)實(shí)驗(yàn)給出可重現(xiàn)和一致的結(jié)果。
接種物大小優(yōu)化
圖3顯示在YES培養(yǎng)基中接種不同孢子濃度（10^2-10^6孢子/毫升）后獲得的平均O.D./時(shí)間曲線（十個(gè)個(gè)體曲線）。為研究重復(fù)間變異性，獲得曲線平均的均方根誤差（RMSE）。結(jié)果表明較低孢子負(fù)載導(dǎo)致較高曲線分散（RMSE；1x10^2孢子/毫升=0.357；1x10^3孢子/毫升=0.286），而當(dāng)使用較高濃度時(shí)分散較?。≧MSE；1x10^5孢子/毫升=0.118；1x10^6孢子/毫升=0.151）。非常高濃度孢子產(chǎn)生初始O.D.輕微增加?；谶@些結(jié)果，選擇最終接種物1x10^5孢子/毫升用于所有后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
孔體積優(yōu)化
檢查不同體積YES培養(yǎng)基含10^5孢子/毫升黃曲霉以確定最佳使用體積。鑒于最大孔體積為500μl，測(cè)試體積為200、250、300、350和400μl。平均生長(zhǎng)曲線（每種處理十個(gè)重復(fù)）顯示盡管使用最高體積是最低量的兩倍，曲線非常相似（圖4）。此外，不同平均曲線RMSE值之間未發(fā)現(xiàn)差異，范圍從0.097到0.132。
不同O.D.值下真菌生物量比較
微孔板含50孔加載400μl YES接種1x10^6和1x10^4孢子/毫升黃曲霉，培養(yǎng)后每小時(shí)后計(jì)算生物量，初始培養(yǎng)13小時(shí)后。兩種濃度生物量對(duì)O.D.讀數(shù)結(jié)果如圖5所示。通常，生物量隨O.D.增加而增加。當(dāng)兩種初始濃度達(dá)到相似O.D.讀數(shù)時(shí)，獲得的生物量幾乎相同，表明O.D.和生物量之間直接關(guān)系。
不同環(huán)境條件下PTS效果
在不同環(huán)境條件下，使用八種不同濃度PTS獲得的平均生長(zhǎng)曲線如圖6所示。使用Microsoft®Excel®模板獲得所有環(huán)境條件下O.D.為0.2的TTD，該模板使用連續(xù)O.D.讀數(shù)之間的線性插值預(yù)測(cè)O.D.=0.2時(shí)的TTD。這些數(shù)據(jù)使用LPM（方程（1））分析。計(jì)算模型參數(shù)和95%置信區(qū)間。獲得值如表1所示。
盡管觀察到Po值差異（表明不同環(huán)境對(duì)在沒(méi)有抑制劑情況下達(dá)到O.D.=0.2所需時(shí)間的影響），參數(shù)P1和P2在統(tǒng)計(jì)上無(wú)差異（P>0.05）。這表明盡管獲得的菌絲量不同（20°C vs 25°C和aw 0.995 vs 0.95），PTS的效果在不同條件下保持相同。PTS的效果在此短范圍內(nèi)獨(dú)立于溫度和aw。
MIC、NIC和MIC50計(jì)算及與LD50值和視覺(jué)觀察比較
使用前一節(jié)獲得的參數(shù)，根據(jù)方程（2）-（4）計(jì)算MIC、NIC和MIC50，及其95%置信限。LD50值通過(guò)比較使用Baranyi模型獲得的生長(zhǎng)速率計(jì)算。所有數(shù)據(jù)比較如表2所示。計(jì)算的所有四種環(huán)境條件的NIC、MIC和MIC50在統(tǒng)計(jì)上無(wú)差異（P>0.05）。這些相似性顯示PTS的有效性獨(dú)立于這些環(huán)境條件。
在模型中，Po取決于環(huán)境條件，除了PTS。此外，作為環(huán)境因素獨(dú)立性的證明，相對(duì)RTD對(duì)PTS濃度的表示已繪制（圖7）。這顯示所有數(shù)據(jù)落在同一線上，證明真菌行為對(duì)相同PTS濃度相似。7天后，MIC值準(zhǔn)確預(yù)測(cè)在YES平皿中50 ppm PTS下未觀察到生長(zhǎng)。
與LD50值相比，獲得的MIC50濃度始終小于使用基于延伸速率的傳統(tǒng)方法計(jì)算的值。而LD50值，比較菌落生長(zhǎng)速率，范圍從40到45 ppm，MIC50值，基于比較菌絲生物量，范圍從32到34 ppm。部分原因可能在于MIC50使用計(jì)算的劑量響應(yīng)，而LD50計(jì)算缺少這一點(diǎn)。
表1：LPM參數(shù)和95%置信限。
表2：PTS濃度值的MIC、NIC和MIC50及其95%置信限和LD50值。
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