失活ccpA不會(huì)消除CCR。為了確定fruA對(duì)CCR敏感性的潛在基礎(chǔ)，在補(bǔ)充了0.05%葡萄糖和0.5%菊粉的TV培養(yǎng)基中培養(yǎng)戈登氏鏈球菌DL1和源自DL1的ccpA突變體（圖1）。DL1表現(xiàn)出典型的二次生長(zhǎng)，而ccpA突變體達(dá)到的生長(zhǎng)水平與fruA突變體觀察到的水平相當(dāng)。戈登氏鏈球菌的ccpA突變體在單獨(dú)葡萄糖上生長(zhǎng)幾乎與親本菌株一樣好，因此看來(lái)ccpA突變體失去了利用菊粉的能力。為了研究CcpA在戈登氏鏈球菌fruA和levDEFG基因CCR中的作用，將PfruA-cat和PlevD-cat融合引入ccpA突變體，并在各種生長(zhǎng)碳水化合物中測(cè)量CAT活性（表3和4）。與ccpA突變體在葡萄糖和菊粉組合上的生長(zhǎng)表型一致，當(dāng)細(xì)胞在菊粉上生長(zhǎng)時(shí)，fruA在ccpA突變體中的表達(dá)降低了約120倍。在測(cè)試的所有五種碳水化合物中，ccpA突變體中l(wèi)evD的表達(dá)均較低。因此，與戈登氏鏈球菌ccpA突變體在菊粉上生長(zhǎng)不良（圖1）一致，CcpA的失活可能導(dǎo)致菊粉誘導(dǎo)的fruA和levD表達(dá)的強(qiáng)烈抑制。由于已知CcpA可以作為某些基因和操縱子的轉(zhuǎn)錄激活因子，因此有可能CcpA的缺失導(dǎo)致fruA和levD表達(dá)激活的缺乏。
可以觀察到CcpA對(duì)fruA表達(dá)的抑制效應(yīng)，但對(duì)levD沒有。在變形鏈球菌中，fruA和levD操縱子的表達(dá)由四組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)LevQRST控制，該系統(tǒng)感應(yīng)誘導(dǎo)底物果糖或甘露糖的存在。由于相對(duì)占主導(dǎo)地位的CcpA非依賴性CCR機(jī)制的調(diào)節(jié)，通過CcpA對(duì)變形鏈球菌fruA的CCR僅在果糖脈沖實(shí)驗(yàn)中監(jiān)測(cè)表達(dá)時(shí)才明顯(3)。也就是說，只有當(dāng)細(xì)胞在非誘導(dǎo)碳水化合物中生長(zhǎng)到指數(shù)中期，然后對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行1到3小時(shí)的誘導(dǎo)劑脈沖時(shí)，才能觀察到CcpA介導(dǎo)的CCR證據(jù)。在類似的實(shí)驗(yàn)中，攜帶PfruA-cat或PlevD-cat融合的戈登氏鏈球菌在含有0.5%葡萄糖的TV中孵育至指數(shù)早期(OD600≈0.2)，然后用不同濃度的果糖或菊粉處理3小時(shí)，然后收獲進(jìn)行CAT測(cè)定。如表5所示，當(dāng)果糖濃度從0.05 mM增加到7.5 mM時(shí)，fruA表達(dá)增加了約5倍，PlevD-cat菌株對(duì)果糖的存在有明顯的劑量依賴性反應(yīng)（表5）。類似地，當(dāng)使用菊粉脈沖這些菌株時(shí)，隨著菊粉的添加，levD的表達(dá)出現(xiàn)濃度依賴性增加。
由于菊粉是果糖的聚合物，對(duì)fruA和levD的誘導(dǎo)效應(yīng)可能源于FruA降解菊粉并釋放游離果糖，后者作為誘導(dǎo)信號(hào)。構(gòu)建了一個(gè)fruA敲除突變體，并在突變體中測(cè)試了菊粉誘導(dǎo)PlevD::cat表達(dá)的能力。如表5所示，用菊粉沒有觀察到高于陰性對(duì)照（無(wú)菊粉）水平的誘導(dǎo)，盡管該菌株仍然對(duì)果糖誘導(dǎo)有反應(yīng)（表5）。因此，與變形鏈球菌一樣，菊粉本身似乎不是levD表達(dá)的誘導(dǎo)信號(hào)，而是從菊粉水解中釋放的果糖似乎作為最有效的誘導(dǎo)信號(hào)（表2）。值得注意的是，在這兩種生物中，由FruA從菊粉中釋放的果糖穩(wěn)態(tài)水平仍然低于引發(fā)顯著CCR所需的水平。
當(dāng)評(píng)估PfruA-cat和PlevD-cat融合在果糖脈沖下的表達(dá)時(shí)，在ccpA突變體中fruA出現(xiàn)了2到5倍的去抑制（表5）。然而，在相同條件下，ccpA突變體中l(wèi)evD的表達(dá)總是低于野生型背景中測(cè)量的水平。值得注意的是，在fruA或levD的啟動(dòng)子區(qū)域附近無(wú)法檢測(cè)到明顯的CRE序列。
破壞酶IIMan(manL)消除了fruA和levD的CCR。鑒于ManL在變形鏈球菌CCR中的重要性，在戈登氏鏈球菌中構(gòu)建了manL缺失，并研究了其對(duì)CCR的影響。當(dāng)測(cè)試該突變體在含有0.05%葡萄糖和0.5%菊粉的TV培養(yǎng)基中的二次生長(zhǎng)時(shí)，二次生長(zhǎng)幾乎被消除（圖1）。
當(dāng)在manL突變體背景下使用PfruA-cat和PlevD-cat融合測(cè)量fruA和levD基因表達(dá)時(shí)（表3和4），在所有測(cè)試的碳水化合物中，這兩個(gè)基因相對(duì)于野生型背景中的表達(dá)水平均出現(xiàn)去抑制。根據(jù)levD表達(dá)的數(shù)據(jù)，在甘露糖培養(yǎng)物中觀察到的去抑制水平最高。雖然在葡萄糖和半乳糖中觀察到相似的表達(dá)變化倍數(shù)，但在果糖作為生長(zhǎng)碳水化合物時(shí)，ManL缺陷菌株中觀察到的去抑制量最低。當(dāng)細(xì)胞在TV-菊粉中生長(zhǎng)時(shí)，與野生型背景相比，在manL突變株中觀察到兩個(gè)基因的去抑制約為3倍。
CcpA負(fù)向調(diào)節(jié)manL表達(dá)。由于我們已經(jīng)證明破壞CcpA會(huì)導(dǎo)致大多數(shù)條件下fruA和levD表達(dá)降低（表3和4），并且ManL的缺失通常導(dǎo)致CCR的解除，因此CcpA可能通過調(diào)節(jié)manL間接影響CCR，這似乎是變形鏈球菌中的情況(54)。將ccpA缺失引入manL突變株，并監(jiān)測(cè)雙突變體背景中PfruA-和PlevD-cat融合的表達(dá)。當(dāng)在補(bǔ)充了0.5%葡萄糖、果糖、半乳糖、菊粉或甘露糖的TV中生長(zhǎng)時(shí)，ccpA manL雙突變體產(chǎn)生的CAT活性顯著高于野生型菌株或ccpA突變體（表3和4）。與僅攜帶manL突變的菌株相比，在ccpA manL雙突變體中觀察到的去抑制水平相似。然而，當(dāng)使用半乳糖或甘露糖培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，雙突變體顯示出較低的活性（表3和4）。這些結(jié)果支持了CcpA可能通過影響細(xì)胞中ManL的量來(lái)影響fruA和levD表達(dá)的觀點(diǎn)。
為了進(jìn)一步測(cè)試CcpA是否調(diào)節(jié)manL表達(dá)，構(gòu)建了PmanL-cat融合并將其引入野生型和ccpA突變株。在葡萄糖、果糖或半乳糖中生長(zhǎng)時(shí)，ccpA突變體中PmanL-cat融合的表達(dá)顯著高于野生型背景（表6），這一發(fā)現(xiàn)表明CcpA對(duì)manL的負(fù)向調(diào)節(jié)。同樣值得注意的是，在野生型背景中，半乳糖中的manL表達(dá)高于葡萄糖或果糖，這可能是因?yàn)榕c葡萄糖或果糖相比，半乳糖通過CcpA誘導(dǎo)CCR的效率較低。半乳糖應(yīng)流經(jīng)戈登氏鏈球菌的塔格糖途徑，產(chǎn)生的葡萄糖-6-磷酸(G-6-P)和果糖-1,6-二磷酸(F-1,6-bP)少于在葡萄糖或果糖上生長(zhǎng)。由于G-6-P和F-1,6-bP是HPr激酶的激活劑，因此在半乳糖上生長(zhǎng)的細(xì)胞中，CcpA依賴的manL抑制將不那么嚴(yán)重。與這一概念一致，在缺乏CcpA的菌株中，manL對(duì)不同糖的反應(yīng)表達(dá)水平差異很?。ū?）。
ccpA突變體中fruA和levD啟動(dòng)子活性降低的另一個(gè)可能原因是磷酸載體蛋白HPr的磷酸manL的自調(diào)節(jié)。為了研究戈登氏鏈球菌的ManL是否能夠影響manL的表達(dá)，在manL突變體中測(cè)量了PmanL-cat融合的活性。結(jié)果（表6）表明，當(dāng)在半乳糖中生長(zhǎng)時(shí)，manL啟動(dòng)子的表達(dá)相對(duì)于野生型菌株在manL突變體中去抑制，盡管在葡萄糖或果糖中生長(zhǎng)時(shí)觀察到的變化要小得多。同樣，這種差異可能源于這些糖誘導(dǎo)CCR效率的差異。事實(shí)上，當(dāng)在manL ccpA雙突變體中測(cè)定manL表達(dá)水平時(shí)，在所有測(cè)試的糖中表達(dá)都高度去抑制，表明不同糖中表達(dá)差異與葡萄糖和果糖中相比半乳糖中更有效的CcpA依賴性CCR對(duì)manL的抑制有關(guān)。在manL的啟動(dòng)子區(qū)域還鑒定出一個(gè)潛在的分解代謝物響應(yīng)元件(CRE;TGAAAACG TTTTAT)，它與革蘭氏陽(yáng)性菌中的共有CRE序列(TGWNANCGNTNWCA)僅略有不同。值得注意的是，我們團(tuán)隊(duì)的成員最近觀察到變形鏈球菌中的ManL可以影響manL操縱子的表達(dá)(L.Zeng and R.A.Burne,未發(fā)表數(shù)據(jù))。
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