研究簡(jiǎn)介
本研究揭示了假單胞菌（Pseudomonas putida S16）中尼古丁降解的未知途徑。尼古丁是一種常見的有機(jī)污染物，主要來源于煙草加工廢棄物。假單胞菌能夠利用尼古丁作為碳源和氮源進(jìn)行生長(zhǎng)，但其降解尼古丁的分子機(jī)制尚不清楚。
本研究人員通過蛋白質(zhì)組學(xué)和分子遺傳學(xué)方法，全面分析了假單胞菌在尼古丁和甘油（非抑制性碳源）培養(yǎng)條件下的蛋白質(zhì)表達(dá)差異，揭示了尼古丁降解的關(guān)鍵酶和基因。研究發(fā)現(xiàn)，假單胞菌在尼古丁培養(yǎng)條件下表達(dá)的蛋白質(zhì)組包含1292種蛋白質(zhì)，其中126種蛋白質(zhì)在尼古丁和甘油培養(yǎng)條件下表達(dá)差異顯著。這些差異表達(dá)的蛋白質(zhì)主要涉及運(yùn)輸、解毒、氨基酸代謝等功能。研究還發(fā)現(xiàn)，3-琥珀酰吡啶（SP）轉(zhuǎn)化為6-羥基-3-琥珀酰吡啶（HSP）的關(guān)鍵步驟由一種多酶反應(yīng)催化，涉及鉬蝶呤結(jié)合氧化酶（spmA）、鉬蝶呤脫氫酶（spmB）和（2Fe-2S）結(jié)合鐵氧還蛋白（spmC），并以鉬蝶呤胞嘧啶二核苷酸為輔因子。
此外，研究還克隆并表征了一種新的尼古丁氧化還原酶基因（nicA2）。nicA2與之前已知的nicA1基因（編碼尼古丁氧化還原酶）具有低氨基酸同源性（10.9%）。通過基因敲除實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)刪除nicA2而非nicA1會(huì)阻止假單胞菌對(duì)尼古丁的降解，表明nicA2在尼古丁降解中起關(guān)鍵作用。本研究還構(gòu)建了多個(gè)基因敲除突變株，包括mfs、sapd、pnao和nicA2基因敲除株，進(jìn)一步證實(shí)了這些基因在尼古丁降解中的重要性。
通過蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)的結(jié)合分析，本研究不僅揭示了尼古丁降解的新途徑，還為環(huán)境污染物的生物降解提供了新的靶點(diǎn)。這些發(fā)現(xiàn)對(duì)于理解假單胞菌如何適應(yīng)和降解環(huán)境中的有毒化合物具有重要意義，并可能為未來的生物修復(fù)和生物催化應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。
Bioscreen全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀的應(yīng)用
Bioscreen全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀用于監(jiān)測(cè)和比較不同菌株在特定培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)情況。使用了野生型菌株P(guān)seudomonas putida S16和多個(gè)基因敲除突變株（如S16dspm、S16dmfs、S16dsapd、S16dpnao和S16dnicA2）。這些菌株在含有尼古丁作為唯一碳源和氮源的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。通過連續(xù)監(jiān)測(cè)培養(yǎng)基中的光密度（OD）變化來記錄菌株的生長(zhǎng)曲線。Bioscreen每隔一定時(shí)間（如每小時(shí)）測(cè)量一次培養(yǎng)基的OD值，從而生成詳細(xì)的生長(zhǎng)曲線。通過Bioscreen C獲得的生長(zhǎng)曲線，研究人員能夠直觀地比較野生型菌株和各個(gè)基因敲除突變株在尼古丁培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)差異。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
通過蛋白質(zhì)組學(xué)和分子遺傳學(xué)方法，系統(tǒng)地揭示了假單胞菌（Pseudomonas putida S16）中尼古丁降解的未知途徑。在尼古丁和甘油培養(yǎng)條件下，假單胞菌S16的蛋白質(zhì)組包含1292種蛋白質(zhì)，其中126種蛋白質(zhì)表達(dá)差異顯著。這些差異表達(dá)的蛋白質(zhì)主要涉及運(yùn)輸、解毒、氨基酸代謝等功能，表明假單胞菌在尼古丁存在時(shí)會(huì)調(diào)整其蛋白質(zhì)表達(dá)以適應(yīng)環(huán)境壓力。研究發(fā)現(xiàn)3-琥珀酰吡啶（SP）轉(zhuǎn)化為6-羥基-3-琥珀酰吡啶（HSP）的關(guān)鍵步驟由一種多酶反應(yīng)催化，涉及鉬蝶呤結(jié)合氧化酶（spmA）、鉬蝶呤脫氫酶（spmB）和（2Fe-2S）結(jié)合鐵氧還蛋白（spmC），并以鉬蝶呤胞嘧啶二核苷酸為輔因子。這一發(fā)現(xiàn)填補(bǔ)了尼古丁降解途徑中的關(guān)鍵空白。克隆并表征了一種新的尼古丁氧化還原酶基因（nicA2），其編碼的酶將尼古丁轉(zhuǎn)化為N-甲基假膽堿。nicA2與已知的nicA1基因（編碼尼古丁氧化還原酶）具有低氨基酸同源性（10.9%）。通過基因敲除實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)刪除nicA2而非nicA1會(huì)阻止假單胞菌對(duì)尼古丁的降解，表明nicA2在尼古丁降解中起關(guān)鍵作用。構(gòu)建了多個(gè)基因敲除突變株，包括mfs、sapd、pnao和nicA2基因敲除株，進(jìn)一步證實(shí)了這些基因在尼古丁降解中的重要性。
圖1、銅綠假單胞菌S16的吡咯烷途徑尼古丁代謝圖。A.展示了S16中尼古丁分解代謝的完整步驟。
圖2、尼古丁降解相關(guān)蛋白的表達(dá)水平變化。MS光譜計(jì)數(shù)檢測(cè)到Porin、Mfs、SpmC、SpmA、Sapd、Pnao、NicA2、HspA、HspB和NicA1的表達(dá)。紅色表示尼古丁培養(yǎng)基，藍(lán)色表示甘油培養(yǎng)基。柱狀圖表示歸一化光譜計(jì)數(shù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。
圖3、差異表達(dá)蛋白的轉(zhuǎn)錄水平驗(yàn)證。A.RT-qPCR檢測(cè)9個(gè)目標(biāo)基因的mRNA表達(dá)水平，使用16S rRNA基因作為內(nèi)參。結(jié)果為三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的均值±標(biāo)準(zhǔn)差。B.半定量RT-PCR驗(yàn)證目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄情況，16S rDNA作為內(nèi)控。
圖4、spmABC基因的缺失與互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)。A.野生型S16與spmABC缺失突變株S16Δspm在尼古丁培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線。B.HPLC檢測(cè)野生型與突變株對(duì)尼古丁的降解及SP的積累情況。C.野生型、突變株及攜帶互補(bǔ)質(zhì)粒pME6032-spm100的菌株在尼古丁培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線。D.HPLC檢測(cè)野生型與不同質(zhì)粒攜帶株對(duì)SP的降解情況。
圖5、野生型S16與基因缺失突變株的生長(zhǎng)及靜止態(tài)反應(yīng)。A)在尼古丁平板上生長(zhǎng)情況。B)在含卡那霉素的LB平板上生長(zhǎng)情況。C)野生型、S16Δpnao、S16ΔnicA2在尼古丁培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線。D、E)HPLC檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞與靜止細(xì)胞對(duì)尼古丁的降解情況。
總結(jié)
銅綠假單胞菌(Pseudomonas putida)菌株是少數(shù)能夠利用有毒和外源性化合物（如尼古?。┳鳛樯L(zhǎng)底物的微生物之一。雖然早在50多年前人們就發(fā)現(xiàn)了假單胞菌的尼古丁降解能力，但其潛在的分子機(jī)制一直不清楚。過去幾年中，通過基因組文庫(kù)篩選和野生型酶的純化，做出了大量努力來鑒定3-琥珀酰吡啶（SP）羥基化的關(guān)鍵基因，但這些嘗試均未能找到與SP羥基化相關(guān)的基因。
在本研究中，通過比較遺傳學(xué)分析，本研究首次從P.putida S16中鑒定出三個(gè)關(guān)鍵基因spmA、spmB和spmC。由這些基因編碼的異源三聚體酶需要鉬蝶呤-胞苷二核苷酸（Mo-MCD）作為輔因子。以尼古丁或甘油為唯一碳源培養(yǎng)的S16蛋白質(zhì)組中共檢測(cè)到1292種蛋白質(zhì)，為闡明尼古丁降解相關(guān)酶提供了詳盡的信息。
通過比較尼古丁培養(yǎng)與甘油培養(yǎng)的細(xì)胞蛋白質(zhì)組，研究人員發(fā)現(xiàn)了與尼古丁分解代謝相關(guān)的多種細(xì)胞過程和功能。Bioscreen C在本研究中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，為研究者提供了可靠的生長(zhǎng)分析數(shù)據(jù)，支持了基因功能的驗(yàn)證和尼古丁降解途徑的解析。本研究不僅揭示了尼古丁降解的新途徑，還為理解假單胞菌如何適應(yīng)和降解環(huán)境中的有毒化合物提供了新的視角。這些發(fā)現(xiàn)對(duì)于未來的生物修復(fù)和生物催化應(yīng)用具有重要意義。通過多學(xué)科的方法，全面揭示了假單胞菌S16中尼古丁降解的分子機(jī)制，為環(huán)境污染物的生物降解提供了新的靶點(diǎn)和理論基礎(chǔ)。
相關(guān)新聞推薦
1、醬香型白酒堆積酒醅中分離克羅彭斯特德菌生長(zhǎng)和揮發(fā)性化合物代謝特征（一）
2、畜禽屠宰場(chǎng)環(huán)境和畜禽肉中單增李斯特菌污染情況、生長(zhǎng)曲線及消毒劑最小抑菌濃度分析（二）
3、不同樣品怎么提取微生物？預(yù)包裝食品、液體/固體/空氣/表面等樣品怎么取樣？
4、乙腦病毒株囊膜蛋白I176R位點(diǎn)在BV-2細(xì)胞上的生長(zhǎng)特性差異——結(jié)果與分析