2.3.模擬
使用方程（1）分析T_{text{det}}檢測時間分布對四個（或多或少隨機的）變量N_0、N_{text{det}}、mu和lambda（其分布取決于N_0）的依賴性。模擬研究在Excel中進行，并使用 Risk（Microsoft ExcelTM的風(fēng)險分析加載項，4.05專業(yè)版，Palisade，美國，2000）進行分析，輸入如下：
?每孔初始細胞數(shù)遵循泊松分布，平均每孔1個細胞；
?單細胞的延滯時間lambda(1)假設(shè)為Gamma分布，遵循Baranyi和Pin（2001）的理論。Gamma函數(shù)由兩個參數(shù)alpha和beta定義。在最佳生長條件下（30°C，pH 7，0.5%NaCl），alpha取5，beta=0.5小時，導(dǎo)致單細胞預(yù)期延滯時間平均值為2.5小時（注意2.5小時是單細胞延滯時間的平均值，與群體延滯期不同），標(biāo)準(zhǔn)差為1.12小時。當(dāng)每孔有多個細胞時，延滯時間使用Baranyi和Pin（2001）推導(dǎo)的公式估算。使用與方程（1）相同的符號，
?比生長速率假設(shè)服從正態(tài)分布，平均值為1~h^{-1}，標(biāo)準(zhǔn)差為0.03~h^{-1}。這對應(yīng)于約3%的相對偏差，這是通過生成獨立重復(fù)的活菌計數(shù)生長曲線確定的。圖2顯示了其中四條曲線，來自在最佳條件下培養(yǎng)的培養(yǎng)物。在不太有利的環(huán)境條件下也生成了類似的曲線。它們表明最大比生長速率是一個重現(xiàn)性很好的參數(shù)，在支持生長的環(huán)境中誤差范圍為1-5%。
?檢測水平細胞數(shù)的分布假設(shè)為均勻分布，介于5times 10^{6}和1.5times 10^{7}個細胞/ml之間。
3.結(jié)果與討論
3.1.模擬
使用蒙特卡羅抽樣方法進行一萬次迭代，得到T_{text{det}}檢測時間的標(biāo)準(zhǔn)差為1.25小時，而個體延滯時間的標(biāo)準(zhǔn)差為1.12~h。在方差分析（ANOVA）術(shù)語中，1.12^{2}/1.25^{2}=80%的檢測時間方差可由延滯時間的方差解釋。注意，在此模擬中，延滯時間變異性相對較小。如果細胞受到脅迫，其延滯時間將更加分散，個體延滯時間變異性對總體變異性的貢獻將變得更加主導(dǎo)。
模擬的T_{text{det}}檢測時間保持了Gamma分布的形狀。 Risk中所有可用的分布（對數(shù)正態(tài)分布等）都擬合到T_{text{det}}值。Gamma分布給出了良好的擬合，卡方值高達93%。T_{text{det}}的方差略高于個體延滯時間的方差。
結(jié)論是Gamma分布適合擬合T_{text{det}}值的分布，并且檢測時間的大部分變異性可歸因于延滯時間的變異性。
模擬還表明，為了獲得檢測時間分布的良好估計，所需的陽性孔數(shù)約為100。
3.2.實驗結(jié)果
Gamma分布被證明適合擬合測量的T_{text{det}}檢測時間（圖3）。這與Wu等（2000）的發(fā)現(xiàn)不一致，他們使用正態(tài)分布擬合個體細胞延滯時間的分布。然而，他們報告每次稀釋有40個重復(fù)，根據(jù)我們的經(jīng)驗，這不足以確定哪種分布最佳。
在Bioscreen微孔板的200個孔中，陽性孔的平均數(shù)量始終在125到175之間?；诓此杉僭O(shè)，這意味著在所有實驗中N_{0}的平均值在1到2之間。
我們已經(jīng)確定檢測時間變異性的主要來源是個體延滯時間的變異性。為了測試生長條件的影響是否一致，在每種環(huán)境條件下進行了兩到三次重復(fù)實驗。在給定環(huán)境條件下，檢測時間的總方差被分為三個獨立的方差：
sigma^2_{text{total}}=V_R+V_E+V_H
其中(i)V_R源于Bioscreen讀數(shù)不準(zhǔn)確性；(ii)V_E源于環(huán)境條件影響的變異性；(iii)V_H源于細胞接種時生理狀態(tài)的異質(zhì)性。這是通過檢測時間分布測量的（其主要來源是個體延滯時間的變異性）。
Bioscreen讀數(shù)不準(zhǔn)確性V_R通過高水平接種實驗評估，并假設(shè)在任何環(huán)境條件下相同。環(huán)境條件引起的變異性V_E是在相同條件下進行的實驗中檢測時間均值的方差。均值以檢測時間的標(biāo)準(zhǔn)差加權(quán)。最后，群體異質(zhì)性引起的變異性V_H是通過從給定環(huán)境條件下集合的平均總方差中減去前述方差得到的。結(jié)果以R^{2}百分比表示，即由于接種時細胞生理狀態(tài)異質(zhì)性引起的總變異性比例（表1）。在大多數(shù)情況下，環(huán)境條件的重復(fù)是令人滿意的（群體異質(zhì)性引起的變異性高于95%）。然而，對于在pH 5.0或5.5下進行的實驗，情況并非如此；在這些低pH值下，結(jié)果無法一致地重復(fù)。
表1
不同環(huán)境條件下檢測時間的變異性來源
主要來源通常是細胞初始生理狀態(tài)的異質(zhì)性V_H，除了在低pH值時，環(huán)境因素影響的變異性V_E可能具有同等權(quán)重。
正如預(yù)期，生長條件抑制性越強，檢測時間越長，其分布越分散。在圖4中，對于每種生長條件，檢測時間的標(biāo)準(zhǔn)差對其平均值作圖?？梢钥闯?，在所研究的環(huán)境因素區(qū)域內(nèi)，檢測時間的標(biāo)準(zhǔn)差與其平均值之間的關(guān)系大致是線性的。然而值得注意的是，在NaCl濃度為4%時，標(biāo)準(zhǔn)差幾乎與0.5%時保持相同水平，然后才增加。這與Patchett等（1992）的結(jié)果一致，他們發(fā)現(xiàn)鉀和甜菜堿等滲透保護劑的增加（隨著NaCl濃度增加而在細胞中積累）從約5%的NaCl濃度開始顯著增加。
4.結(jié)論
控制病原菌延滯時間的變異性對于生產(chǎn)安全食品（例如最小加工食品）是可取的。然而，從技術(shù)上講，獲取足夠且足夠準(zhǔn)確的單個細胞延滯時間數(shù)據(jù)是困難的。濁度檢測時間可能提供解決此問題的方法。正如我們所表明的，如果初始細胞數(shù)較低，檢測時間變異性的主要來源接近于個體延滯時間的變異性。作為初步近似，可以在檢測時間與其標(biāo)準(zhǔn)差之間建立線性關(guān)系dev(T)~T。然而，如果生長緩慢，那么其他來源（“噪聲”）可能匹配原始變異性的比例，并且線性關(guān)系可能不易被觀察/重現(xiàn)。
致謝
這項工作部分在食品研究所項目CSG 434.1213A下準(zhǔn)備，部分由歐盟項目QoL 2000-01145（BACANOVA）資助。