1.3.7 SCB2505代謝物對(duì)液化沙雷氏菌細(xì)胞壁完整性的影響
取1.3.2節(jié)所得菌懸液500μL至2 mL離心管中,再取質(zhì)量濃度分別為1.0 MIC、2.0 MIC和4.0 MIC代謝物溶液500μL加到離心管中,使代謝物終質(zhì)量濃度分別為0.5 MIC、1.0 MIC、2.0 MIC,以無菌去離子水替代代謝物作為對(duì)照,每個(gè)濃度3個(gè)管,于28℃培養(yǎng)4 h。5 000 r/min,4℃離心10 min,取上清液。參考AKP試劑盒步驟進(jìn)行操作,測(cè)定上清液中AKP活力。
1.3.8 SCB2505代謝物對(duì)液化沙雷氏菌細(xì)胞膜完整性的影響
參照蘇曉丹[18]的PI染色法并稍作修改。取1.3.2節(jié)所得菌懸液500μL至2 mL離心管中,再取濃度分別為1.0 MIC、2.0 MIC和4.0 MIC代謝物溶液500μL加到上述離心管中,使代謝物終質(zhì)量濃度分別為0.5 MIC、1.0 MIC、2.0 MIC,以無菌去離子水替代代謝物作為對(duì)照,每個(gè)濃度3個(gè)管,于28℃培養(yǎng)4 h。將培養(yǎng)好的菌液以5 000 r/min,4℃離心10 min,棄上清液,所得菌體用PBS重懸洗滌2次后,離心棄上清液,PBS重懸,加入PI染料(終質(zhì)量濃度為10μg/mL),4℃避光孵育30 min,PBS重懸洗滌2次,離心棄上清液,PBS重懸,取菌懸液10μL在熒光顯微鏡下觀察。激發(fā)波長(zhǎng)為535 nm,發(fā)射波長(zhǎng)為615 nm。
1.3.9 SCB2505代謝物對(duì)液化沙雷氏菌細(xì)胞形態(tài)的影響
取1.3.2節(jié)所得菌懸液20 mL于50 mL離心管中,再取濃度分別為1.0 MIC、2.0 MIC和4.0 MIC代謝物溶液20 mL加到上述管中,使代謝物終質(zhì)量濃度分別為0.5 MIC、1.0 MIC、2.0 MIC,以無菌去離子水替代代謝物作為對(duì)照,于28℃培養(yǎng)10 h。將培養(yǎng)好的菌液4 000 r/min離心10 min,棄上清液,所得到的菌體用PBS重懸洗滌2次后,將菌體懸浮于2.5%戊二醛-PBS溶液固定(4℃)。過夜后用PBS洗滌菌體3次,后置于1%鋨酸中固定30 min,隨后用不同濃度的乙醇梯度洗脫。最后將樣品滴加至專用玻片并貼附于場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡載物臺(tái),用臨界點(diǎn)干燥儀干燥8 h后鍍金,使用場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡(field-emission scanning electron microscope,FESEM)觀測(cè)細(xì)菌細(xì)胞形態(tài)。
1.3.10數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析
采用Origin 2022軟件(OriginLab Corporation,USA)進(jìn)行繪圖,SPSS Statistics 26.0(IBM Corp.,USA)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA分析或t檢驗(yàn),實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取測(cè)定結(jié)果的平均值,數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。
2結(jié)果與分析
2.1 SCB2505代謝物MIC的測(cè)定
由表1可知,對(duì)于液化沙雷氏菌SCB2649菌株,植物乳桿菌SCB2505代謝物質(zhì)量濃度為4 mg/mL時(shí),液體培養(yǎng)基渾濁,指示菌液化沙雷氏菌SCB2649菌株有明顯的生長(zhǎng)現(xiàn)象發(fā)生,但質(zhì)量濃度為8 mg/mL的試管中液體清澈,指示菌SCB2649菌株無明顯的生長(zhǎng)現(xiàn)象,因此植物乳桿菌SCB2505代謝物對(duì)該指示菌的MIC可確定為8 mg/mL。
表1 SCB2505代謝物對(duì)液化沙雷氏菌最小抑菌濃度
注:“+”代表渾濁;“-”代表澄清。
2.2 SCB2505代謝物對(duì)液化沙雷氏菌生長(zhǎng)曲線的影響
由圖1可知,對(duì)照組的液化沙雷氏菌SCB2649菌株在24 h內(nèi)快速增長(zhǎng),在24 h時(shí)OD600nm值為0.912。加入植物乳桿菌SCB2505代謝物濃度為0.5 MIC時(shí),液化沙雷氏菌SCB2649菌株生長(zhǎng)受到明顯的抑制作用,相同時(shí)間的OD值明顯低于對(duì)照組。加入代謝物濃度達(dá)到1.0 MIC時(shí),液化沙雷氏菌SCB2649菌株生長(zhǎng)完全被抑制,24 h內(nèi)其OD600nm值沒有變化。說明植物乳桿菌SCB2505代謝物濃度達(dá)到1.0 MIC時(shí),在液體培養(yǎng)時(shí)也能夠有效抑制液化沙雷氏菌SCB2649菌株生長(zhǎng)繁殖。
圖1 SCB2505代謝物對(duì)液化沙雷氏菌SCB2649菌株生長(zhǎng)的影響
2.3 SCB2505代謝物抑菌成分分析
2.3.1熱穩(wěn)定性
如表2所示,經(jīng)70℃處理20 min后,SCB2505代謝物對(duì)液化沙雷氏菌SCB2649菌株的抑菌效果與對(duì)照組相比無顯著差異(P>0.05),而100℃和121℃處理后的代謝物抑菌效果顯著下降(P<0.05),但相對(duì)抑菌活性仍有90%左右保留。說明植物乳桿菌SCB2505代謝物中抑菌活性物質(zhì)具有較好的耐熱性,但可能其中有部分抑菌物質(zhì)對(duì)熱較為敏感。
表2高溫處理對(duì)SCB2505代謝物抑菌活性的影響
注:采用t檢驗(yàn)分析實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組抑菌圈直徑的顯著性差異(P<0.05),以*表示。
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