摘要豆科作物根瘤菌被噬菌體浸染后，在一定程度上會引起根瘤菌數(shù)目和結(jié)瘤量的降低，進而導(dǎo)致共生固氮作用弱化和作物產(chǎn)量的顯著下降。然而，目前關(guān)于根瘤菌噬菌體的相關(guān)研究報道較少。本研究以3株模式根瘤菌，即慢生型大豆根瘤菌、中華大豆根瘤菌和中華苜蓿根瘤菌為宿主，于黑土農(nóng)田土壤中采用雙層平板培養(yǎng)法從每個宿主細(xì)菌分離3株噬菌體，共分離獲得9株根瘤菌噬菌體，對其形態(tài)結(jié)構(gòu)及生物學(xué)特征進行綜合分析。結(jié)果表明：侵染苜蓿根瘤菌噬菌體（SMM）和慢生型根瘤菌噬菌體（BDM）屬于肌尾噬菌體科，而侵染中華根瘤菌噬菌體（SSS）隸屬于長尾噬菌體科。9株噬菌體的最佳感染復(fù)數(shù)均在0.001——1.0的變化范圍內(nèi)。一步生長曲線結(jié)果顯示，BDM的潛伏期和爆發(fā)期明顯長于SMM和SSS，但獲得的裂解量最小。根瘤菌噬菌體在30——40℃和中性pH條件下侵染活性最大。對比發(fā)現(xiàn)，侵染同一宿主的噬菌體生物學(xué)特征雖存在一定差異，但分異度遠(yuǎn)小于不同宿主噬菌體間的差異。
根瘤菌（rhizobia）可以侵染豆科植物根部形成根瘤，固定空氣中的分子態(tài)氮形成氨，為植物提供氮素營養(yǎng)，是一類與農(nóng)業(yè)生產(chǎn)關(guān)系密切的革蘭氏陰性細(xì)菌。目前隨著根瘤菌分類系統(tǒng)的不斷補充和完善，以表型和遺傳型分類為基礎(chǔ)，根瘤菌科已發(fā)展到7屬36種，其主要來源于變形菌門（Proteobacteria）中的“Alpha”和“Beta”變形菌亞門。隨著根瘤菌基因組測序研究的不斷發(fā)展，我國學(xué)者對26株中華根瘤菌屬（Sinorhizobium）和慢生根瘤菌屬（Bradyrhizo-bium）兩屬代表菌株進行比較基因組學(xué)分析，研究成果推動了根瘤菌基因組學(xué)的發(fā)展。根瘤菌對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)至關(guān)重要，但根瘤菌噬菌體（rhizobiophages）廣泛存在于土壤、根圍和根瘤中，被認(rèn)為是影響土壤根瘤菌組成、種群數(shù)量以及結(jié)瘤固氮的主要生物因素。由于噬菌體生態(tài)學(xué)和基因組學(xué)研究的相對滯后，關(guān)于根瘤菌噬菌體的相關(guān)研究目前還報道較少
細(xì)菌病毒也稱噬菌體，是一類感染細(xì)菌、古菌等原核微生物病毒的總稱。噬菌體在自然生態(tài)系統(tǒng)中廣泛存在，其不僅是地球上最大的遺傳基因庫，而且在控制其宿主群落演替、遺傳基因的水平移動，以及生物進化中起到重要的橋梁作用。根瘤菌噬菌體可以侵染根瘤菌并且會導(dǎo)致其退化甚至死亡，有研究發(fā)現(xiàn)，噬菌體侵染根瘤菌后會顯著降低根瘤菌數(shù)目和結(jié)瘤量，進而導(dǎo)致固氮作用和作物產(chǎn)量呈顯著降低的趨勢。噬菌體可以通過減少土壤中易結(jié)瘤菌株種群密度來影響豆科植物與根瘤菌之間的共生關(guān)系。噬菌體侵染根瘤菌后，導(dǎo)致根瘤菌在基因水平上發(fā)生變異，使其喪失固氮功能，導(dǎo)致有效根瘤菌數(shù)量及種類的降低，繼而降低根瘤菌的共生固氮作用。因此，以目標(biāo)根瘤菌株為誘餌，對分離獲得的根瘤菌噬菌體研究有助于了解不同根瘤菌屬共生固氮體系的退化機制。
鑒于此，本研究以慢生型大豆根瘤菌（Bradyrhi-zobium diazoefficiens USDA110T）、中華大豆根瘤菌（Sinorhizobium sojae CCBAU05684T）和中華苜蓿根瘤菌（Sinorhizobium meliloti USDA1002T）3株模式菌株為宿主，從土壤中分離獲得不同根瘤菌宿主的噬菌體株，對其形態(tài)特征、最佳感染復(fù)數(shù)（MOI）、一步生長曲線及對溫度、pH和紫外光穩(wěn)定性等指標(biāo)進行分析，旨在明晰噬菌體與根瘤菌間的侵染關(guān)系，了解根瘤菌噬菌體的生物學(xué)特征，為根瘤菌噬菌體生態(tài)學(xué)的發(fā)展奠定基礎(chǔ)。
1材料與方法
1.1供試菌株和病毒溶液
供試菌株為中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)微生物資源及其應(yīng)用重點開放實驗室提供的3株不同類型的模式根瘤菌株，其中包括慢生型大豆根瘤菌、中華大豆根瘤菌和中華苜蓿根瘤菌。土樣樣本采集于中國科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所試驗田（45°41′N,126°38′E）。取采集的新鮮土樣5g,放入裝有10mLYMA （KH2PO40.25g,K2HPO40.25g,MgSO4·7H2O0.20g,pH7.0）液體培養(yǎng)基的三角瓶中，200r·min——1搖床振蕩過夜培養(yǎng)?；旌弦?2000′g離心15min,上清液采用0.22μm濾膜進行過濾，收集獲得的過濾液即為土壤病毒溶液。
1.2研究方法
1.2.1噬菌體的分離與純化參照Nakayama等方法進行噬菌體的侵染與分離。取1mL過濾后土壤懸液與0.2mL宿主菌液（對數(shù)生長期）混合后，加入5mLYMA液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)48h.培養(yǎng)液12000xg4℃離心10min,上清液經(jīng)0.22μm濾膜過濾，獲得噬菌體原液。取1mL噬菌體原液與0.2mL生長至對數(shù)生長期的宿主菌懸液混合，孵育15min后，加入6mL冷卻至47℃的YMA半固體培養(yǎng)基，倒入預(yù)先準(zhǔn)備已凝固的YMA固體培養(yǎng)基平板，制成雙層平板。室溫放置30min左右，倒置放入28℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)觀察雙層平板出現(xiàn)噬菌斑后，即獲得以相應(yīng)根瘤菌為宿主的噬菌體株。
采用重復(fù)挑取單個噬菌斑、連續(xù)與目標(biāo)根瘤菌宿主懸液共培養(yǎng)的方法，進行根瘤菌噬菌體的純化即挑取單個較大的、邊緣光滑的噬菌斑放入裝有1 mL SM緩沖液（0.1 mol·L-1 NaCl,8 mmol·L-1 MgSO4·7H2O,50 mmol·L-1 Tris-HCl,0.005%（W·V-1）甘油，pH 7.0）的離心管中，4℃靜止保存12h后，12000xg4℃離心10min,取0.1mL上清液做連續(xù)10倍稀釋，分別取1mL稀釋液與0.2mL對數(shù)生長期的菌液（OD600≈0.5）混勻后，制成雙層平板重新獲得噬菌斑，連續(xù)重復(fù)上述步驟4——5次后，即可獲得純化的根瘤菌噬菌體株。
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