摘要:提升菌株酸耐受能力在工業(yè)生產(chǎn)中有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值。研究發(fā)現(xiàn)，乳酸乳球菌F44中一種功能未知的DeoR/GlpR家族轉(zhuǎn)錄因子RdrA與菌株酸耐受能力相關(guān)。為研究RdrA對F44菌株耐酸性能的影響，比較rdrA缺陷型、過表達(dá)菌株和F44原始菌株的生長曲線、pH曲線、酸耐受、Nisin耐受和Nisin效價(jià),對RdrA的功能進(jìn)行表征。此外,對rdrA缺陷突變型菌株和F44原始菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序,進(jìn)一步研究RdrA影響F44菌株酸耐受的靶標(biāo)基因和代謝通路。轉(zhuǎn)錄組測序和qPCR結(jié)果表明，RdrA主要通過抑制細(xì)胞被膜的流動(dòng)性和韌性,降低胞內(nèi)蛋氨酸水平,以及抑制DNA分子修復(fù)和蛋白修飾過程,降低F44酸耐受能力。研究首次揭示未知功能的轉(zhuǎn)錄因子RdrA,為提高乳酸乳球菌耐酸性能提供了新的研究方向和分子靶點(diǎn)，在工業(yè)生產(chǎn)中具有重要意義。
乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)是一種革蘭氏陽性菌，被美國食品和藥物管理局(FDA)認(rèn)定為一般公認(rèn)安全(GRAs)的微生物，廣泛應(yīng)用于功能性食品工業(yè)。
乳酸鏈球菌素(Nisin)是乳酸乳球菌發(fā)酵產(chǎn)生的一種羊毛硫氨酸細(xì)菌素，具有主要針對革蘭氏陽性菌的抑菌活性，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食品保鮮行業(yè)。Nisin的抑菌機(jī)制主要有兩種:其一，Nisin通過與細(xì)胞壁肽聚糖合成過程中的必需中間體一脂質(zhì)體II結(jié)合，抑制細(xì)菌細(xì)胞壁合成，使細(xì)菌細(xì)胞變形死亡;其二，Nisin作用于細(xì)胞膜形成孔道，破壞細(xì)胞跨膜電位和pH梯度，造成胞內(nèi)物質(zhì)流失，使細(xì)胞裂解死亡。Nisin生產(chǎn)菌株對Nisin具有特定的保護(hù)機(jī)制，主要通過ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(NisFEG)將胞內(nèi)Nisin排出體外,并通過膜結(jié)合脂蛋白(NisI)于胞外結(jié)合Nisin形成不溶性復(fù)合物，避免細(xì)胞膜被Nisin攻擊。
由于乳酸乳球菌代謝產(chǎn)酸的特性，酸脅迫是乳酸菌生長過程中面臨的主要環(huán)境壓力。乳酸菌生長的最適環(huán)境pH為5.5~6.0，然而隨著發(fā)酵過程的進(jìn)行，乳酸逐漸積累使胞內(nèi)外pH下降，影響胞內(nèi)多種酶活性，破壞細(xì)胞被膜結(jié)構(gòu)，引起細(xì)胞死亡。目前，乳酸菌進(jìn)化出多種耐酸機(jī)制，如生物被膜修飾、三磷酸腺苷依賴型質(zhì)子泵系統(tǒng)、氨基酸脫氨與脫羧系統(tǒng)以及大分子保護(hù)與修復(fù)等響應(yīng)酸應(yīng)激。除此之外，轉(zhuǎn)錄因子也能通過影響酸應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)，調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝活動(dòng)，適應(yīng)環(huán)境變化。如乳酸乳球菌F44中PspC家族轉(zhuǎn)錄因子YthA參與精氨酸脫亞胺酶(ADI)途徑并促進(jìn)精氨酸生物合成，幫助菌株抵御酸應(yīng)激并提高Nisin產(chǎn)量。雙組份系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄因子TcsR7上調(diào)DLT操縱子轉(zhuǎn)錄水平，降低細(xì)胞膜內(nèi)外電勢差，提高乳酸乳球菌F44耐酸能力。在乳酸乳球菌CECT8666中，胍胍丁胺通過胍胍丁胺脫亞胺酶水解催化產(chǎn)生腐胺和銨鹽來抵抗酸脅迫,同時(shí)介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子AguR結(jié)合aguB啟動(dòng)子，激活aguBDAC操縱子的轉(zhuǎn)錄以提高菌株酸耐受能力。
乳酸乳球菌轉(zhuǎn)錄因子RdrA屬于DeoR/GlpR家族，該家族主要調(diào)控碳水化合物代謝或核苷酸代謝過程,多數(shù)情況下通過形成阻遏蛋白抑制相關(guān)代謝途徑的糖磷酸效應(yīng)分子，起抑制性轉(zhuǎn)錄因子的作用。在大腸桿菌中，DeoR和GlpR分別調(diào)節(jié)脫氧核糖核酸代謝途徑和sn-甘油三磷酸代謝途徑的基因表達(dá)。近年研究發(fā)現(xiàn)，DeoR/GlpR家族轉(zhuǎn)錄因子也與環(huán)境耐受相關(guān)。在單核細(xì)胞增生李斯特氏菌中，DeoR家族轉(zhuǎn)錄因子FruR是一種果糖操縱子轉(zhuǎn)錄抑制蛋白，可以通過誘導(dǎo)磷酸戊糖途徑基因表達(dá)和抑制糖酵解基因表達(dá)來調(diào)控單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的碳代謝，同時(shí)產(chǎn)生還原型輔酶II保護(hù)菌株響應(yīng)氧化應(yīng)激。豬鏈球菌中GlpR抑制甘油代謝酶基因表達(dá)，在抑制甘油利用效率的同時(shí)提升豬鏈球菌抵御氧化應(yīng)激能力，并且提升菌株在巨噬細(xì)胞中的存活率和細(xì)胞毒力。耐金屬貪銅菌中敲除glpR基因使菌株對高濃度鋅脅迫抗性增強(qiáng)。
乳酸乳球菌F44中DeoR/GlpR家族轉(zhuǎn)錄因子RdrA的具體功能目前尚未研究。本試驗(yàn)旨在探究轉(zhuǎn)錄因子RdrA對乳酸乳球菌酸耐受和Nisin產(chǎn)量的影響，并通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序技術(shù)尋找RdrA下游調(diào)控靶標(biāo)，探索其基因功能，解析RdrA調(diào)控機(jī)制，為進(jìn)一步工程改造乳酸乳球菌奠定基礎(chǔ)。
1材料與方法
1.1材料與設(shè)備
1.1.1菌株與試劑
菌株:乳酸乳球菌F44,實(shí)驗(yàn)室保藏菌種;敲除rdrA基因的F44菌株,本試驗(yàn)構(gòu)建菌株,記作DeltardrA;過表達(dá)rdrA基因的F44菌株,本試驗(yàn)構(gòu)建菌株,記作FrdrA。
蔗糖、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、鹽酸、十二水合磷酸氫二鈉，上海麥克林生化科技股份有限公司;蛋白胨胨、氯化鈉、D-無水葡萄糖、七水合硫酸鎂、半胱氨酸、瓊脂粉、NisinZ標(biāo)準(zhǔn)品,北京索萊寶科技有限公司;酵母粉、胰蛋白胨胨，英國Oxoid公司;玉米漿，北京奧博星生物技術(shù)有限公司;細(xì)菌總RNA提取試劑盒DP430，天根生化科技(北京)有限公司;2xSYBRGreenqPCRMix試劑盒,山東思科捷生物技術(shù)有限公司。
1.1.2培養(yǎng)基
改良LB培養(yǎng)基:胰蛋白胨胨10g/L,酵母粉5g/L,氯化鈉10g/L,D-無水葡萄糖5g/L,調(diào)節(jié)pH至7.0。
乳酸乳球菌種子培養(yǎng)基:蔗糖15g/L,蛋白胨胨15g/L,酵母粉15g/L,磷酸二氫鉀20g/L,氯化鈉1.5g/L,七水合硫酸鎂0.15g/L,調(diào)節(jié)pH至7.0。
發(fā)酵培養(yǎng)基:在種子培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入3g/L玉米漿和2.6g/L半胱氨酸。
效價(jià)培養(yǎng)基:D-無水葡萄糖5g/L,胰蛋白胨胨8g/L,酵母粉2.5g/L,十二水合磷酸氫二鈉5g/L,氯化鈉5g/L,調(diào)節(jié)pH至7.2。
以上固體培養(yǎng)基另行加入15g/L瓊脂粉。
1.1.3儀器設(shè)備
HFsafe-1200LC生物安全柜,香港力康生物醫(yī)療科技公司;5200Multi發(fā)光成像系統(tǒng)，上海天能生命科學(xué)有限公司;UV-1800PC紫外分光光度計(jì),翱藝儀器(上海)有限公司;GL-1908高低溫振蕩金屬浴,海門市其林貝爾儀器制造有限公司;LightCycler480II實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司。
1.2方法
1.2.1菌株構(gòu)建
1.2.1.1rdrA過表達(dá)菌株構(gòu)建
使用p124-rdrA-F/R引物擴(kuò)增F44基因組中rdrA基因,以pLEB124質(zhì)粒為載體,使用BamHI和HindIII酶切位點(diǎn)連接至載體上。將重組質(zhì)?；瘜W(xué)轉(zhuǎn)化至大腸桿菌TG1中，提取質(zhì)粒，將測序正確的重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化進(jìn)入乳酸乳球菌F44中，使用pLEB124-YZ-F/R引物進(jìn)行菌落PCR并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。設(shè)計(jì)引物如表1所示。
表1rdrA過表達(dá)菌株構(gòu)建引物序列
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