摘要:旨在建立豬乳腺上皮細胞(PMEC)的原代培養(yǎng)方法，為豬乳腺發(fā)育、分化及泌乳機制研究和病原體感染提供生物材料和細胞模型。以9月齡未孕健康母豬的乳腺組織為研究對象，利用膠原酶Ⅰ型和透明質酸酶聯(lián)合消化法分離PMEC，通過形態(tài)學觀察、生長曲線測定、間接免疫熒光試驗(IFA)、聚合酶鏈式反應(PCR)、免疫印跡試驗(Western blot)對其進行鑒定。結果:經酶消化組織塊法獲得的PMEC呈現(xiàn)鵝卵石狀、上皮樣形態(tài)并形成單層聚集形島嶼，凍存復蘇后細胞生長狀態(tài)良好，且純化后的PMEC具備正常的“S”型生長周期;經濃度為0.2 mg/L與2 mg/L的催乳素刺激PMEC后，采用PCR、Western blot方法檢測發(fā)現(xiàn)細胞中β-酪蛋白(CNS2)的表達水平顯著升高(P<0.05)，且升高趨勢與催乳素的濃度呈正相關;IFA結果顯示分離的PMEC表達特異性標記物細胞角蛋白18(CK-18)，且表達緊密連接蛋白(ZO-1)，表明該細胞形成良好的緊密連接。本研究成功建立了PMEC的分離、培養(yǎng)及鑒定體系，為進一步研究乳腺生物學及相關機制奠定了基礎。
乳腺作為哺乳動物體內獨有的腺體組織，承載著新生動物獲取寶貴初乳的重任。乳腺上皮細胞(MEC)可合成并分泌乳蛋白、乳糖和脂類，是機體黏膜免疫系統(tǒng)的一部分，是抵御病原體的第一道屏障。MEC具有分泌特異性β-酪蛋白(CNS2)的特性，這一特性進一步強調了其在乳汁合成過程中的核心地位。在妊娠與哺乳這一生命循環(huán)的關鍵階段，MEC在催乳素的精密調控下，經歷了從增殖到分化的精妙轉變。這種激素不僅是啟動產乳過程的“鑰匙”，更是維持整個哺乳期間乳汁持續(xù)分泌的“引擎”。通過調節(jié)MEC的活性與功能，催乳素確保了哺乳動物能夠順利地進行哺乳，為后代的健康成長提供堅實的營養(yǎng)保障。
已報道多種病毒可經乳汁進行垂直傳播，如寨卡病毒(ZIKV)、人類免疫缺陷病毒(HIV)、巨細胞病毒(CMV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)等。盡管有研究者試圖對病毒經乳汁垂直傳播的機制進行研究，但由于難以在圍生期母體體內獲取組織樣本以及合適的實驗動物模型的缺乏限制了對其他研究。因此，當前亟需開發(fā)并建立一種可靠的細胞模型，以模擬并解析病毒經乳汁垂直傳播的復雜過程，這對于理解病毒傳播機制、評估公共衛(wèi)生風險以及制定有效的防控策略具有至關重要的意義。
在本研究中，首先通過酶消化組織塊法分離出豬乳腺上皮細胞(PMEC)，其次通過連續(xù)傳代對細胞進行純化，并進行生長曲線的測定。最后通過間接免疫熒光試驗(IFA)、聚合酶鏈式反應(PCR)和免疫印跡試驗(Western blot)從分子水平和蛋白水平對PMEC進行鑒定，結果表明本研究成功分離出PMEC，對闡明營養(yǎng)物質和激素刺激豬乳腺合成乳汁的潛在機制具有重要的生物意義，同時為病原體經乳汁傳播的機制研究提供工具。
1材料與方法
1.1試驗動物及組織采集
選擇健康的9月齡未懷孕、未妊娠長白母豬(來源于保定某豬場)，將其麻醉后，使用75%酒精將母豬發(fā)育良好的乳房及其周圍進行消毒，使用高壓滅菌的手術器械割開表皮組織，沿筋膜表面分離乳腺組織，切除乳腺，半徑為2~3 cm，深度約為皮下3 cm，將切割下來的組織放入含75%酒精的燒杯中，3~5 min后，將組織放入含2%雙抗的PBS溶液中浸泡5 min左右，便于分離PMEC。
1.2主要試劑
DMEM/F12培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶、青-鏈霉素(雙抗)、胎牛血清(FBS)，購自Gibco公司(美國);氫化可的松、無動物成分重組人表皮生長因子(EGF)蛋白、細胞角蛋白18(CK-18)多克隆抗體，購自Bioss公司(北京);ECL化學發(fā)光超敏顯色試劑盒、牛胰島素，購自翌圣生物科技(上海)股份有限公司;慶大霉素、膠原蛋白酶A、透明質酸酶，購自泰克蘭博公司(北京);催乳素購自Med Chem Express生物科技公司(美國);細胞裂解液、100%甲醇、抗CNS2單克隆抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗鼠免疫球蛋白G(IgG)、HRP標記的山羊抗兔IgG，購自索萊寶科技有限公司(北京);兔抗β-肌動蛋白(β-actin)多克隆抗體購自Servicebio公司(武漢);Protein Marker購自上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司;細胞計數(shù)試劑盒(CCK-8檢測試劑盒)購自APExBIO公司(美國);緊密連接蛋白(ZO-1)抗體購自Invitrogen公司(美國);YF488山羊抗鼠IgG、YF594山羊抗兔IgG，購自蘇州優(yōu)逸蘭迪生物科技有限公司。
1.3試驗方法
1.3.1豬乳腺的采集與PMEC的分離
為從9月齡非懷孕、非妊娠期母豬的乳腺中分離PMEC，采用高壓滅菌后的手術器械將母豬發(fā)育良好的乳腺(上層皮膚、中間組織及下層肌肉)取下，放入含75%醫(yī)用酒精的燒杯中消毒5 min左右，再將其轉入含2%雙抗的PBS中洗滌10遍左右，用高壓消毒的手術器械將乳腺的上層皮膚及下層肌肉剝離，并將其剪切為約1 mm3的組織塊，移入含30 mL添加有5%FBS、2%雙抗溶液、50 mg/L慶大霉素、500 mg/L膠原酶A及0.05%透明質酸酶DMEM消化培養(yǎng)基的50 mL離心管中，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中消化12 h。消化完畢后，將懸液經70 nm過濾器過濾到50 mL離心管中，離心2 000 r/min，8 min。棄去上清液，再用含2%雙抗溶液的DMEM培養(yǎng)液重懸沉淀，共洗滌2次，離心2 000 r/min，8 min。最后用1 mL含5 mg/L牛胰島素、5 mg/L氫化可的松、10 ng/mL EGF、50 mg/L慶大霉素、10%FBS和2%雙抗的DMEM培養(yǎng)液重懸沉淀，將其轉移到T25細胞培養(yǎng)瓶中，補充營養(yǎng)液至6 mL。根據細胞生長情況適當換液。
1.3.2 PMEC的傳代和凍存
棄去細胞瓶中的營養(yǎng)液，用PBS洗滌2次，洗去殘留營養(yǎng)液，加入胰酶-EDTA消化，邊消化邊拍打，待細胞脫壁后，加入含胎牛血清的營養(yǎng)液終止消化，然后根據細胞生長情況對細胞進行1∶3傳代。將生長情況良好的細胞保存在凍存液中，放入液氮罐長期保存。
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