9.長(zhǎng)雙歧桿菌亞種sueorum DK001的基因組特征
接下來(lái)，我們進(jìn)行了DK001的全基因組測(cè)序。Nanopore測(cè)序?yàn)镈K001產(chǎn)生了約226，248條讀長(zhǎng)（每條DNA片段被測(cè)出來(lái)的堿基序列長(zhǎng)度）。這些讀長(zhǎng)的N50和N90分別為19，374和4，962，足以生成高質(zhì)量的基因組草圖。DK001的基因組大小為2，389，232 bp，GC含量為61.11%，呈環(huán)狀（圖8a）。
基因組包含57個(gè)tRNA、4個(gè)5S rRNA、4個(gè)16S rRNA、4個(gè)23S rRNA和1個(gè)sRNA。值得注意的是，DK001擁有4個(gè)CRISPR區(qū)域和2052個(gè)基因。其中，67個(gè)基因在毒力因子數(shù)據(jù)庫(kù)（VFDB）中有記錄，4個(gè)基因在抗生素抗性數(shù)據(jù)庫(kù)（ARDB）中有記錄，76個(gè)基因在碳水化合物活性酶數(shù)據(jù)庫(kù)（CAZy）中有記錄。
尤為重要的是，我們的分析表明，DK001包含10個(gè)碳水化合物結(jié)合模塊（CBMs）、5個(gè)碳水化合物酯酶（CEs）、56個(gè)糖基水解酶（GHs）和10個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶（GTs），這些酶在多糖降解中發(fā)揮重要作用。隨后，我們分別對(duì)DK001進(jìn)行了COG功能分類(lèi)和KEGG通路分類(lèi)分析。COG功能分類(lèi)和KEGG通路分類(lèi)分析分別鑒定了169個(gè)和125個(gè)與碳水化合物代謝相關(guān)的富集基因（圖8bc）。
此外，我們還對(duì)DK001基因組進(jìn)行了分析，并與來(lái)自韓國(guó)的兩種長(zhǎng)雙歧桿菌亞種sueorum菌株進(jìn)行了比較。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)26個(gè)與碳水化合物代謝相關(guān)的基因是DK001菌株所特有的（圖8d）?？傮w而言，我們通過(guò)全基因組測(cè)序首次描述了DK001的基因組特征。
圖8.使用Nanopore平臺(tái)對(duì)DK001進(jìn)行基因組測(cè)序。（a）DK001的環(huán)狀圖。（b）DK001的COG功能分類(lèi)。（c）DK001的KEGG通路分類(lèi)。（d）通過(guò)GO分析確定DK001特有的基因。
10.GH1和PL9可能被激活以分解L01-B1
盡管我們觀察到L01-B1增加了長(zhǎng)雙歧桿菌亞種sueorum DK001的豐度，但體外實(shí)驗(yàn)表明L01-B1無(wú)法直接支持DK001的生長(zhǎng)（圖S12a）。然而，它促進(jìn)了具核梭桿菌（Bacteroides thetaiotaomicron）的生長(zhǎng)（圖S12b）。因此，我們通過(guò)CAZy數(shù)據(jù)庫(kù)分析了所有細(xì)菌的糖苷酶。主成分分析（PCA）和主坐標(biāo)分析（PCoA）顯示兩組完全分離（圖S13a&b）。群落柱狀圖分析表明，與對(duì)照組相比，GH1的豐度顯著更高（圖9a）。在科水平上的熱圖分析也顯示，經(jīng)過(guò)L01-B1處理后GH1的豐度增加（圖9b）。兩組比較顯示GH1顯著富集（圖9c）。同樣地，我們發(fā)現(xiàn)PL9的豐度顯著增加（圖9d）。此外，LEfSe分析顯示GH1和PL9均顯著增加（圖9e&f）。綜合來(lái)看，我們可能得出結(jié)論：GH1和PL9是降解L01-B1的關(guān)鍵酶。
圖9.基于宏基因組測(cè)序的碳水酶分析。（a）科水平上的群落柱狀圖分析。（b）科水平上的熱圖分析。（c）通過(guò)對(duì)照組和L01-B1組比較分析糖基水解酶（GHs）。（d）通過(guò)對(duì)照組和L01-B1組比較分析多糖裂解酶（PLs）。（e）通過(guò)LEfSe分析GHs。（f）通過(guò)LEfSe分析PLs。數(shù)據(jù)代表技術(shù)重復(fù)三次（n=4）。對(duì)于兩組之間的比較，采用非配對(duì)雙尾學(xué)生t檢驗(yàn)。
11.L01-B1改變了人類(lèi)腸道微生物群的代謝物
鑒于L01-B1改變了人類(lèi)腸道微生物群的組成，并且長(zhǎng)雙歧桿菌亞種sueorum得到了富集，我們?cè)噲D研究潛在的代謝物變化。主坐標(biāo)分析（PCoA）顯示對(duì)照組和L01-B1組完全分離（圖10a）。偏最小二乘判別分析（PLS-DA）也顯示對(duì)照組和L01-B1組完全分離（圖10b）。代謝物差異豐度分析顯示，有190種化合物增加，而81種代謝物減少（圖10c）。隨后，我們將這些增加的代謝物進(jìn)行了分類(lèi)。結(jié)果顯示，增加的代謝物可以分為6類(lèi)，包括氨基酸、有機(jī)酸、糖類(lèi)、吲哚、核苷和維生素及其衍生物（圖10d–i）。KEGG分析顯示，差異豐度代謝物主要富集在糖類(lèi)和氨基酸代謝途徑中?？傊?，這些結(jié)果突出表明L01-B1可能會(huì)改變?nèi)祟?lèi)腸道微生物群的代謝物。
圖10.通過(guò)類(lèi)靶向代謝組測(cè)序檢測(cè)代謝物。（a）主坐標(biāo)分析（PCoA）。（b）偏最小二乘判別分析（PLS-DA）。（c）火山圖顯示的差異代謝物分析。熱圖顯示的差異代謝物：（d）氨基酸，（e）有機(jī)酸，（f）糖類(lèi)，（g）吲哚，（h）核苷。（i）維生素C。（j）KEGG通路分析。數(shù)據(jù)代表技術(shù)重復(fù)五次（n=5）。P值通過(guò)學(xué)生t檢驗(yàn)計(jì)算。
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