摘要：盡管果膠已被廣泛研究，但由于其結(jié)構(gòu)復(fù)雜，關(guān)于其對(duì)腸道微生物群影響的知識(shí)仍存在空白。本研究旨在探究果膠是否能夠體外富集腸道微生物群。為此，我們從卷丹百合花中提取了一種分子量為43.9 kDa的均質(zhì)RG-Ⅰ型果膠，命名為L(zhǎng)01-B1。結(jié)構(gòu)分析表明，L01-B1含有鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、半乳糖和阿拉伯糖，其摩爾比為13.4：1.8：11.1：37.2：36.5。L01-B1的主鏈由1,6-β-半乳糖苷、1,4-α-半乳糖醛酸苷和1,2-α-鼠李糖醛酸苷組成，而側(cè)鏈則包括連接到鼠李糖C-4位的1,5-α-阿拉伯糖苷、1,4-β-半乳糖苷和T-β-葡萄糖醛酸，以及連接到半乳糖C-3位的1,3-β-半乳糖苷和T-β-半乳糖苷。
研究表明，L01-B1能夠體外改變?nèi)四c道微生物群的組成，并增加長(zhǎng)雙歧桿菌的豐度。此外，我們從人糞便中分離并鑒定出長(zhǎng)雙歧桿菌亞種sueorum的DK001菌株。DK001的基因組為環(huán)狀結(jié)構(gòu)，基因組大小約為2.4 M。值得注意的是，L01-B1可能通過(guò)兩種酶降解并改變?nèi)四c道微生物群的代謝?？偟膩?lái)說(shuō)，這些發(fā)現(xiàn)為針對(duì)長(zhǎng)雙歧桿菌的干預(yù)策略提供了見(jiàn)解。
【前言】
越來(lái)越多的證據(jù)表明，多糖是塑造腸道微生物群組成的主要因素之一。例如，果膠、木聚糖、木葡聚糖、阿拉伯木聚糖和阿拉伯聚糖等多糖可被人類(lèi)腸道微生物群降解，其分子機(jī)制也得到了深入研究。此外，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，多糖能夠選擇性或特異性地富集某些細(xì)菌種類(lèi)。更重要的是，許多被選擇性富集的細(xì)菌種類(lèi)可能具有預(yù)防疾病的功能，比如肥胖、代謝功能障礙相關(guān)脂肪性肝炎等。因此，研究能夠選擇性促進(jìn)對(duì)人類(lèi)健康有益的細(xì)菌種類(lèi)生長(zhǎng)的多糖具有重要意義。
果膠廣泛存在于自然界中，且具有極其復(fù)雜的結(jié)構(gòu)。通常，果膠由五大主要結(jié)構(gòu)單元組成：鼠李半乳糖醛酸I、鼠李半乳糖醛酸II、均半乳糖醛酸、木半乳糖醛酸和阿拉伯半乳糖醛酸。由于果膠對(duì)人類(lèi)健康的益處，近年來(lái)受到了廣泛關(guān)注。作為一種膳食纖維，果膠可在體外被人類(lèi)腸道中的擬桿菌屬細(xì)菌降解。果膠幾乎完整地抵達(dá)大腸，并在那里被500到1000種不同的微生物利用。從水果中提取的果膠能夠增加宿主腸道中某些有益菌群的豐度，而從多種植物中提取的果膠也能顯著提升益生菌（如雙歧桿菌和乳酸菌）的含量。然而，目前尚不清楚從植物中提取的果膠究竟選擇性富集了哪些特定的細(xì)菌種類(lèi)，果膠結(jié)構(gòu)與腸道微生物之間的關(guān)聯(lián)也一直模糊不清。
卷丹百合花屬于百合屬，作為一種傳統(tǒng)藥物和飲食來(lái)源，具有豐富的應(yīng)用歷史，因其多樣的藥理特性而展現(xiàn)出巨大潛力。卷丹百合花含有多種化合物，包括多糖、皂苷、酚類(lèi)、生物堿和黃酮類(lèi)。通常，卷丹百合的鱗莖被用于傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)。以往的研究主要集中在具有抗氧化和免疫調(diào)節(jié)活性的百合鱗莖多糖。然而，對(duì)于來(lái)自卷丹百合花的多糖，研究相對(duì)較少。尤其是果膠，作為卷丹百合花的主要生物活性成分，因其潛在的健康促進(jìn)功能（如促進(jìn)血管生成、免疫調(diào)節(jié)和抗過(guò)敏效應(yīng)）而受到學(xué)術(shù)界的廣泛關(guān)注。因此，研究和鑒定來(lái)自卷丹百合花的新型多糖具有重要意義。
總的來(lái)說(shuō)，我們推測(cè)卷丹百合花中的多糖可能具有富集核心細(xì)菌群落或特定種類(lèi)的生物活性。為此，我們提取了一種果膠多糖L01-B1，并解析了其結(jié)構(gòu)。通過(guò)多組學(xué)、微生物技術(shù)和全基因組測(cè)序，我們探討了L01-B1對(duì)體外人腸道微生物群的影響。我們的研究結(jié)果可能拓展草藥多糖的功能，并為未來(lái)發(fā)現(xiàn)新的益生菌提供線索。
【結(jié)果部分】
1.L01-B1的分離與純化
通過(guò)沸水提取和乙醇沉淀法，從2.0 kg百合花中獲得粗多糖LLP（80 g，提取率4%）。隨后，利用DEAE-Sepharose Fast Flow柱層析（離子交換柱）分離，從0.1 mol/L NaCl洗脫液中得到LLP-01（4.16 g，占2.0 kg百合花的0.2%）。接著，通過(guò)Sephacryl S-300HR凝膠滲透色譜柱進(jìn)一步純化LLP-01，得到三個(gè)組分，各組分中的多糖在大小和電荷方面相似。第二個(gè)組分被命名為L(zhǎng)01-B1（711 mg，占2.0 kg百合花的0.03%）。圖1a展示了L01-B1的分離純化流程。L01-B1的高效液相色譜（HPLC）圖譜（圖1b）顯示一個(gè)單一的對(duì)稱尖峰，平均分子量為43.9 kDa，表明其在分子量和電荷分布上均具有均一性。苯酚-硫酸法測(cè)定結(jié)果顯示，L01-B1中中性糖含量為85.23%；間羥基聯(lián)苯法測(cè)定結(jié)果顯示，L01-B1中糖醛酸含量為11.41%。此外，BCA蛋白定量分析表明，L01-B1中不含蛋白質(zhì)。
圖1.（a）從百合花中純化L01-B1的流程圖。（b）通過(guò)高效液相色譜法（HPLC）檢測(cè)的L01-B1的均一性。
2.L01-B1的傅里葉變換紅外光譜（FTIR）分析
L01-B1的紅外光譜分析結(jié)果如圖S2所示。譜圖顯示出多糖的特征吸收峰。其中，3394.67 cm?1處的峰對(duì)應(yīng)于O–H的伸縮振動(dòng)，2936.13 cm?1處的峰代表C–H的伸縮振動(dòng)。在1417.85–1041.73 cm?1范圍內(nèi)的信號(hào)歸因于C–O鍵，而1728.96 cm?1處的峰表明存在羧基C=O的伸縮振動(dòng)，這表明多糖中含有糖醛酸。
3.單糖組成及部分酸水解
單糖組成分析在高效陰離子交換色譜（HPGPC）譜圖中顯示出五個(gè)峰，相應(yīng)的單糖比例見(jiàn)表1。與標(biāo)準(zhǔn)單糖譜圖（圖S3a）對(duì)比，確定L01-B1中的單糖峰為鼠李糖（Rha）、葡萄糖醛酸（GlcA）、半乳糖醛酸（GalA）、半乳糖（Gal）和阿拉伯糖（Ara），其摩爾比為13.4：1.8：11.1：37.2：36.5（圖S3b）。L01-B1經(jīng)過(guò)糖醛酸還原后，生成還原多糖RL01-B1。結(jié)果表明，RL01-B1中半乳糖（Gal）和葡萄糖（Glc）含量的增加對(duì)應(yīng)于L01-B1中半乳糖醛酸（GalA）和葡萄糖醛酸（GlcA）含量的增加。
表1 L01-B1、RL01-B1、L01-B02-I、RL01-B02-I和L01-B105-I的單糖組成
部分酸水解后，通過(guò)透析分離得到的截留液和透析液經(jīng)過(guò)冷凍干燥，分別得到L01-B102-I和L01-B102-O。通過(guò)HPGPC評(píng)估L01-B102-I的均一性，結(jié)果顯示其為均一組分，平均分子量為26.5 kDa。隨后，L01-B1在0.5 M三氟乙酸（TFA）中進(jìn)一步水解，經(jīng)過(guò)冷凍干燥后得到L01-B105-I（截留液）和L01-B105-O（透析液）。HPGPC分析表明，L01-B105-I的分子量為22.9 kDa，與L01-B102-I相近。此外，L01-B105-I的單糖組成與L01-B102-I相似。L01-B102-I和L01-B105-I的1H和13C核磁共振（NMR）譜圖相似（圖S4），表明兩者代表了L01-B1的重復(fù)單元結(jié)構(gòu)。因此，L01-B102-I被確定為L(zhǎng)01-B1的主鏈結(jié)構(gòu)。
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