2 結(jié)果與分析
2.1 動物雙歧桿菌NX-6的菌株生長特性
由圖1A可知，在37 ℃厭氧培養(yǎng)的條件下動物雙歧桿菌NX-6的對數(shù)生長期為2～8 h，之后進(jìn)入穩(wěn)定期。如圖1B、C所示，NX-6菌體呈彎曲狀，菌體長度為1～2 μm。為評估其腸道環(huán)境耐受能力，利用人工胃腸液處理穩(wěn)定期的動物雙歧桿菌NX-6和動物雙歧桿菌BB12 3 h，測定其存活率。如圖1D、E所示，NX-6經(jīng)人工胃液和腸液處理3 h后存活率分別為65.67%和56.47%，高度顯著高于商業(yè)化模式菌株動物雙歧桿菌BB12的存活率（44.87%和41.50%）（P＜0.001），表明動物雙歧桿菌NX-6具有良好的腸道環(huán)境耐受能力。
圖1 動物雙歧桿菌NX-6的菌株生長特性
2.2 動物雙歧桿菌NX-6的全基因組測序分析
為了全面分析動物雙歧桿菌NX-6的菌株特性，對其進(jìn)行全基因組學(xué)測序分析，并結(jié)合生物信息學(xué)進(jìn)行基因注釋與功能預(yù)測。由圖2A、表1可知，動物雙歧桿菌NX-6的全基因總長為1 944 136 bp，GC堿基占比為60.49%，含有1 567 個編碼基因，占總基因數(shù)目的95.49%；非編碼RNA共74 個，包括12 個rRNA和52 個tRNA。利用KEGG數(shù)據(jù)庫對NX-6的基因功能通路進(jìn)行注釋和統(tǒng)計，結(jié)果表明NX-6的基因主要聚集在新陳代謝、遺傳信息處理和環(huán)境信息處理，其中新陳代謝通路主要包括碳水化合物代謝（199 個基因）、氨基酸代謝（162 個基因）、核酸代謝（88 個基因）、能量代謝（69 個基因）、輔助因子與維生素代謝（61 個基因）、脂質(zhì)代謝（43 個基因）、糖的生物合成與代謝（36 個基因）、次級代謝產(chǎn)物合成（31 個基因）等（圖2B）。COG數(shù)據(jù)庫注釋結(jié)果同樣表明，代謝相關(guān)的基因功能主要集中于氨基酸、碳水化合物、核酸、脂質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝（圖2C）。此外，VFDB數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果表明，動物雙歧桿菌NX-6基因組中無毒力基因，證明其生物安全性。特別的是，動物雙歧桿菌具有豐富的脂質(zhì)代謝通路以及色氨酸代謝通路基因簇。
表1 動物雙歧桿菌NX-6基因組信息
圖2 動物雙歧桿菌NX-6的全基因組測序與生物信息學(xué)分析
2.3 動物雙歧桿菌NX-6對斑馬魚體內(nèi)TG和TC含量的影響
如圖3A、B所示，當(dāng)NX-6濃度為1×104、1×105、1×106 CFU/mL時，斑馬魚油紅O染色變淺，且測得斑馬魚體內(nèi)相對脂肪水平分別為（132.31±14.76）%、（119.87±8.19）%、（101.14±5.27）%，隨著NX-6濃度的增加，斑馬魚體內(nèi)相對脂肪水平降低，與模型組（（184.38±7.06）%）相比高度顯著降低（P＜0.001），說明動物雙岐桿菌NX-6在實(shí)驗(yàn)濃度下能降低斑馬魚體內(nèi)脂肪含量。由圖3C、D所示，當(dāng)NX-6濃度為1×104、1×105、1×106 CFU/mL時，斑馬魚體內(nèi)TC含量分別為（0.091±0.001）、（0.099±0.002）、（0.093±0.003）μmol/mg，高度顯著低于模型組（（0.120±0.002）μmol/mg）（P＜0.001），TG含量分別為（0.090±0.001）、（0.031±0.000）、（0.100±0.001）μmol/mg，高度顯著低于模型組（（0.131±0.002）μmol/mg）（P＜0.001）。
圖3 動物雙歧桿菌NX-6對斑馬魚體內(nèi)脂肪含量的影響
2.4 動物雙歧桿菌NX-6發(fā)酵上清液的非靶向代謝組學(xué)分析
為了確定NX-6中起降脂功效的關(guān)鍵代謝物，對其發(fā)酵上清液進(jìn)行非靶向代謝組學(xué)測定。主成分分析（principal component analysis，PCA）結(jié)果表明，NX組與BS組相互獨(dú)立且不同，說明NX-6的代謝活動顯著改變了培養(yǎng)基中的物質(zhì)成分（圖4A、B）。對所有代謝物進(jìn)行差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）分析，并在每種模式的火山圖中突出顯示FC＞1.5或FC＜0.67且P＜0.05的差異代謝物，結(jié)果如圖4C、D所示。NX組和BS組之間的代謝物譜有顯著差異?；谄钚《伺袆e分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）進(jìn)一步尋找差異代謝物，結(jié)果表明PLS-DA模型穩(wěn)定可靠，兩組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（圖4E、F）。
圖4 動物雙歧桿菌NX-6發(fā)酵上清液的非靶向代謝組學(xué)分析
采用t檢驗(yàn)選取變量投影重要性（variable importance in projection，VIP）＞1且P＜0.05的代謝物作為鑒別代謝物，在陰離子模式下檢出42 個差異上調(diào)代謝物、55 個差異下調(diào)代謝物；在陽離子模式下檢出57 個差異上調(diào)代謝物、72 個差異下調(diào)代謝物。相比于BS組，2-吲哚酮和吲哚-3-甲酸含量分別上調(diào)5.57 倍和4.61 倍，是富集程度最高的色氨酸代謝產(chǎn)物及其衍生物（表2）。
表2 動物雙歧桿菌NX-6發(fā)酵上清液中FC排名前10的差異代謝物
2.5 動物雙歧桿菌NX-6對斑馬魚中2-吲哚酮、吲哚-3-甲酸含量的影響
為了驗(yàn)證動物雙歧桿菌NX-6色氨酸代謝衍生物2-吲哚酮和吲哚-3-甲酸在斑馬魚體內(nèi)是否富集。靶向測定動物雙歧桿菌NX-6處理后高脂血癥模型斑馬魚體內(nèi)的2-吲哚酮與吲哚-3-甲酸含量，結(jié)果如圖5所示。與模型組相比，NX-6處理后斑馬魚體內(nèi)的2-吲哚酮含量無明顯變化，吲哚-3-甲酸含量高度顯著提升1.56 倍（P＜0.001），因此推測吲哚-3-甲酸是降低斑馬魚體內(nèi)脂質(zhì)積累的關(guān)鍵代謝物。
圖5 動物雙歧桿菌NX-6對高脂血癥模型斑馬魚體內(nèi)2-吲哚酮與吲哚-3-甲酸含量的影響
2.6 吲哚-3-甲酸對斑馬魚體內(nèi)TC和TG含量的影響
利用斑馬魚高脂血癥模型評估吲哚-3-甲酸的降脂功效，分別使用不同濃度的吲哚-3-甲酸處理模型斑馬魚，測定斑馬魚體內(nèi)的TC與TG含量。如圖6所示，當(dāng)吲哚-3-甲酸濃度為25、50、100 μmol/L時，斑馬魚體內(nèi)TC含量分別為（0.111±0.002）、（0.108±0.001）、（0.101±0.002）μmol/mg，高度顯著低于模型組（（0.148±0.001）μmol/mg）（P＜0.001），TG含量分別為（0.110±0.001）、（0.099±0.002）、（0.092±0.001）μmol/mg，高度顯著低于模型組（（0.170±0.001）μmol/mg）（P＜0.001）。
圖6 吲哚-3-甲酸對高脂血癥斑馬魚模型TC（A）和TG（B）含量的影響
3 討論與結(jié)論
斑馬魚作為脂質(zhì)代謝研究模型已有大量文獻(xiàn)報道，本研究采用標(biāo)準(zhǔn)化的高脂飼料喂食斑馬魚，可導(dǎo)致斑馬魚體內(nèi)的TC和TG水平升高、脂質(zhì)積累，這與He Linfeng等的研究結(jié)果基本一致。在本研究中，NX-6與商業(yè)模式菌株動物雙歧桿菌BB12相比，具有更好的腸道環(huán)境耐受能力。為了更好地探究NX-6的功能，對其基因組進(jìn)行分析，結(jié)果顯示NX-6具有豐富的脂質(zhì)代謝通路基因簇以及色氨酸代謝通路。進(jìn)一步研究了動物雙歧桿菌NX-6對高脂血癥模型斑馬魚的降血脂作用。結(jié)果表明，NX-6降低了高脂飲食斑馬魚體內(nèi)的TG和TC含量，與KEGG、COG和VFDB數(shù)據(jù)庫分析預(yù)測一致，表現(xiàn)出了促進(jìn)脂質(zhì)代謝的功能。
腸道菌群中的色氨酸代謝通路在調(diào)節(jié)能量穩(wěn)態(tài)中起著重要作用，作為機(jī)體內(nèi)色氨酸代謝的三大途徑之一，腸道微生物群將色氨酸轉(zhuǎn)化為吲哚及其衍生物，主要包括吲哚丙烯酸、吲哚-3-乙酸（indole-3-acetic acid，IAA）、吲哚-3-丙酸（indole-3-propionic acid，IPA）、吲哚-3-乙醛和色胺等物質(zhì)。多項(xiàng)研究表明，色氨酸吲哚衍生物在機(jī)體維持腸道和全身穩(wěn)態(tài)、免疫平衡中發(fā)揮重要的作用，IPA的減少會導(dǎo)致小鼠巨噬細(xì)胞中miR-142-5p的異常過表達(dá)，進(jìn)而加速動脈粥樣硬化的進(jìn)展；補(bǔ)充蘿卜硫素，增加了高脂飲食喂食小鼠體內(nèi)IAA的水平，豐富了腸道微生物菌群，進(jìn)而降低了機(jī)體炎癥強(qiáng)度。通過非靶向代謝組學(xué)分析NX-6發(fā)酵上清液與BS組的差異代謝物，發(fā)現(xiàn)NX-6發(fā)酵上清液中色氨酸衍生代謝物吲哚-3-甲酸和2-吲哚酮的含量明顯上升。結(jié)合2.3節(jié)和2.4節(jié)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推測吲哚-3-甲酸和2-吲哚酮是促進(jìn)高脂血癥斑馬魚脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵代謝物。進(jìn)一步分析NX-6作用后的斑馬魚勻漿液，結(jié)果顯示吲哚-3-甲酸含量高度顯著上升（P＜0.001）。最后利用高脂血癥斑馬魚模型評價不同濃度吲哚-3-甲酸的降血脂功效，結(jié)果顯示，與模型組相比，加入吲哚-3-甲酸后斑馬魚體內(nèi)的TG、TC含量高度顯著降低（P＜0.001），且與其濃度呈正相關(guān)，由此說明動物雙歧桿菌NX-6可通過提高吲哚-3-甲酸的含量促進(jìn)高脂血癥斑馬魚的脂質(zhì)代謝。但本研究仍存在一定不足，未能確定吲哚-3-甲酸促進(jìn)TG和TC代謝的具體作用靶點(diǎn)和分子機(jī)制，仍需要進(jìn)一步研究。
綜上所述，動物雙歧桿菌NX-6是一株具備耐受腸道環(huán)境脅迫能力、無毒力基因且可通過其代謝物吲哚-3-甲酸發(fā)揮降脂作用的益生菌，本研究結(jié)果可為調(diào)節(jié)糖脂代謝益生菌產(chǎn)品的開發(fā)奠定基礎(chǔ)，也為益生菌降脂機(jī)制的研究提供了新思路。
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