2.3抑制物脅迫下原始菌株和馴化菌株的發(fā)酵性能比較
為了更好地評(píng)價(jià)馴化后酵母菌株對(duì)抑制物的耐受性影響，對(duì)含有不同濃度抑制物的葡萄糖發(fā)酵液中原始酵母菌株和馴化菌株的乙醇發(fā)酵性能進(jìn)行了研究。在釀酒酵母的親本菌株培養(yǎng)中，添加2.0 g/L糠醛可以顯著抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，培養(yǎng)基中葡萄糖的含量幾乎未被消耗。與W303-1A相比，馴化后的5株菌在48 h內(nèi)達(dá)到穩(wěn)定，具有通常觀察到的滯后期，并完全消耗葡萄糖(50 g/L)，表明馴化后的菌株已經(jīng)適應(yīng)了糠醛環(huán)境。在相同的糠醛脅迫條件下，F(xiàn)-2菌株的生長(zhǎng)明顯優(yōu)于其他馴化菌株，發(fā)酵24 h時(shí)，F(xiàn)-2菌株乙醇產(chǎn)量為8.96 g/L，比其他4株馴化菌株高2.43?6.29 g/L(圖3A、3B)，這一結(jié)果與之前的梯度稀釋實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，馴化后的5株菌最終的乙醇濃度幾乎相同，而出發(fā)菌株W303-1A最終的乙醇濃度約為2.66 g/L，遠(yuǎn)低于馴化后菌株的發(fā)酵效率。馴化菌株在培養(yǎng)基中消耗了幾乎所有的葡萄糖，最大乙醇濃度為19.40 g/L，葡萄糖轉(zhuǎn)化率為94.4%。以上結(jié)果表明馴化菌株具有較高的糠醛耐受性，乙醇產(chǎn)量比出發(fā)菌株高2倍。Li等將釀酒酵母菌株E7在復(fù)合抑制劑中馴化，獲得進(jìn)化菌株E7403在36 h即可消耗培養(yǎng)基中全部葡萄糖(50 g/L)，最終的乙醇產(chǎn)量也比原始菌株E7多了22.9%。Liu等利用進(jìn)化工程獲得了一株對(duì)糠醛和5-羥甲基糠醛(5-hydroxymethylfurfural,HMF)耐受的菌株，其在20 mmol/L的糠醛和HMF的存在下，48 h葡萄糖被完全消耗且乙醇產(chǎn)量正常，相比之下，原始菌株的細(xì)胞生長(zhǎng)則完全被抑制，未產(chǎn)生顯著的乙醇。這一結(jié)果與本研究觀察到的現(xiàn)象相似。
圖3不同濃度的糠醛、對(duì)羥基苯甲酸和糠醛+對(duì)羥基苯甲酸抑制脅迫下原始菌株和馴化菌株的發(fā)酵性能比較。
A：2.0 g/L糠醛抑制下的葡萄糖和OD600濃度變化；B：2.0 g/L糠醛抑制下的乙醇濃度變化；C：2.0 g/L對(duì)羥基苯甲酸抑制下的葡萄糖和OD600濃度變化；D：2.0 g/L對(duì)羥基苯甲酸抑制下的乙醇濃度變化；E：1.6 g/L糠醛+對(duì)羥基苯甲酸抑制下的葡萄糖和OD600濃度變化；F：1.6 g/L糠醛+對(duì)羥基苯甲酸抑制下的乙醇濃度變化。
本研究測(cè)試了出發(fā)菌株W303-1A和馴化菌株在含2.0 g/L對(duì)羥基苯甲酸的葡萄糖培養(yǎng)基中的發(fā)酵情況(圖3C、3D)。所有的菌株均能在含有對(duì)羥基苯甲酸的培養(yǎng)液中生長(zhǎng)，對(duì)照菌株和馴化后的5株菌生長(zhǎng)和發(fā)酵響應(yīng)相當(dāng)，在發(fā)酵12 h時(shí)，原始菌株出現(xiàn)生長(zhǎng)遲緩，但細(xì)胞生長(zhǎng)在指數(shù)期不受影響。這一結(jié)果表明，在發(fā)酵前期，馴化后的菌株會(huì)導(dǎo)致生長(zhǎng)速度的增加。原始菌株在72 h的葡萄糖發(fā)酵過(guò)程中能夠產(chǎn)生與馴化菌株相似的乙醇量，但在發(fā)酵12 h后觀察到乙醇產(chǎn)量的降低，這可能是由于發(fā)酵液中部分乙醇揮發(fā)導(dǎo)致的。因此，與上述糠醛對(duì)酵母發(fā)酵性能的結(jié)果相比，對(duì)羥基苯甲酸的抑制能力遠(yuǎn)低于糠醛對(duì)酵母細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制，而馴化后的酵母菌株則能有效提升細(xì)胞對(duì)抑制物的耐受性。
在相同的培養(yǎng)條件下，用含有1.6 g/L糠醛和對(duì)羥基苯甲酸的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵性能測(cè)試(圖3E、3F)。原始菌株在含有抑制物的發(fā)酵液中細(xì)胞生長(zhǎng)完全被抑制，其OD600值和發(fā)酵液中葡萄糖的含量幾乎無(wú)變化。在添加1.6 g/L糠醛和對(duì)羥基苯甲酸的條件下，被馴化后的5株菌生長(zhǎng)響應(yīng)相當(dāng)。與出發(fā)菌株W303-1A相比，馴化后菌株的葡萄糖消耗速度更快、消耗量更大，其中B-2和B-4菌株在48 h內(nèi)完全消耗葡萄糖，B-1、B-3和B-5菌株在72 h后發(fā)酵液中的葡萄糖含量也被消耗完全。B-2菌株的乙醇產(chǎn)生速率比其他4株馴化菌都要快，且在48 h獲得最大乙醇濃度，為20.22 g/L，葡萄糖轉(zhuǎn)化率為98.4%，比在糠醛抑制物下馴化菌株高4.0%。B-2菌株產(chǎn)生的乙醇濃度是出發(fā)菌株的7.6倍。在混合抑制物脅迫下的生長(zhǎng)和發(fā)酵響應(yīng)規(guī)律與單一抑制物存在的時(shí)有所不同，這可能是兩種抑制物間存在協(xié)同作用。研究表明多種抑制物的協(xié)同作用對(duì)發(fā)酵性能的影響高于單一發(fā)酵抑制物。Wang等通過(guò)協(xié)同因子(continuous integration,CI)值來(lái)判斷化合物是否具有協(xié)同作用，得出糠醛，香草酸，HMF和甲酸對(duì)酵母的生長(zhǎng)具有明顯的協(xié)同抑制作用，同時(shí)對(duì)胞內(nèi)ADH酶活和ATP含量也可能具有協(xié)同抑制作用，且協(xié)同抑制作用大于單一抑制作用。因此本研究利用糠醛和對(duì)羥基苯甲酸對(duì)酵母菌株進(jìn)行馴化十分有意義，結(jié)果也表明馴化后的菌株對(duì)混合抑制物的耐受顯著增強(qiáng)，或許一定程度上了解除了乙醇發(fā)酵中的抑制物協(xié)同作用。
本研究利用馴化策略在不同程度上提高了釀酒酵母在單一和混合抑制物脅迫下的生長(zhǎng)和發(fā)酵性能。研究表明微生物通過(guò)短期馴化獲得的抑制物耐受表型不能在后代中穩(wěn)定遺傳，并有學(xué)者推測(cè)發(fā)生抑制物耐受性提高現(xiàn)象的原因是短期抑制物壓力脅迫使酵母產(chǎn)生應(yīng)激作用，并形成了對(duì)酚酸應(yīng)激反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄記憶而未發(fā)生相關(guān)基因突變。因此本研究選取在上述實(shí)驗(yàn)中發(fā)酵和生長(zhǎng)表型優(yōu)異的進(jìn)化菌株F-2、A-2、B-2進(jìn)行基因組重測(cè)序，進(jìn)一步了解基因型與表型的關(guān)系。
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