2.2.3誘導(dǎo)溫度對(duì)CSP-MDA-7/IL-24表達(dá)的影響
誘導(dǎo)溫度對(duì)CSP-MDA-7/IL-24重組蛋白的表達(dá)有很大影響。如圖4所示，在其他誘導(dǎo)條件相同的情況下，培養(yǎng)溫度為42℃時(shí)，CSP-MDA-7/IL-24蛋白表達(dá)含量占菌體總蛋白的54%，均高于其他溫度。
圖4不同誘導(dǎo)溫度時(shí)重組菌
2.2.4誘導(dǎo)劑IPTG濃度對(duì)CSP-MDA-7/IL-24表達(dá)的影響
誘導(dǎo)劑IPTG通過(guò)誘導(dǎo)pET原核表達(dá)載體中的lacUV5啟動(dòng)子來(lái)過(guò)量表達(dá)T7RNA聚合酶，從而增加目的蛋白的表達(dá)。IPTG濃度對(duì)CSP-MDA-7/IL-24蛋白表達(dá)的影響如圖5所示，在其他誘導(dǎo)條件相同的情況下，IPTG濃度為0.12 mmol/L時(shí)，CSP-MDA-7/IL-24蛋白表達(dá)含量占菌體總蛋白的25.2%。
圖5不同IPTG濃度時(shí)重組菌
2.3正交試驗(yàn)優(yōu)化表達(dá)條件
正交設(shè)計(jì)是一種快速、高效、經(jīng)濟(jì)，能夠研究多因素不同水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法。通過(guò)正交試驗(yàn)分析影響重組菌BL21/pET21b-CSP-MDA-7/IL-24表達(dá)外源蛋白的主要因素，能夠提高目的蛋白的表達(dá)量。通過(guò)正交試驗(yàn)L25（45）對(duì)誘導(dǎo)時(shí)間、培養(yǎng)基pH值、誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)劑IPTG濃度共四因素五水平進(jìn)行優(yōu)化（參數(shù)水平見表1）。圖6為正交試驗(yàn)不同條件下目的蛋白的表達(dá)結(jié)果，正交分析軟件分析四因素五水平對(duì)蛋白表達(dá)量的影響如表2（正交試驗(yàn)結(jié)果與分析）、表3（方差分析）。結(jié)果表明，誘導(dǎo)溫度是CSP-MDA-7/IL-24表達(dá)的主要影響因素，具有顯著性差異；誘導(dǎo)時(shí)間、培養(yǎng)基pH值和誘導(dǎo)劑IPTG濃度對(duì)蛋白表達(dá)的影響較小，無(wú)顯著差異。綜合分析，42℃誘導(dǎo)4 h，培養(yǎng)基pH值為7.0，IPTG濃度為0.12 mmol/L，是CSP-MDA-7/IL-24蛋白表達(dá)的最佳條件。背景清楚等優(yōu)點(diǎn)的原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)。原核系統(tǒng)表達(dá)時(shí)，不同誘導(dǎo)條件在很大程度上影響目的蛋白的表達(dá)量。本實(shí)驗(yàn)中，融合基因CSP-MDA-7/IL-24在大腸桿菌BL21/pET21b表達(dá)
表1正交實(shí)驗(yàn)選取因素及其水平
圖6 SDS-PAGE分析正交試驗(yàn)各條件下目的蛋白的表達(dá)量
表2正交試驗(yàn)結(jié)果
表3正交試驗(yàn)軟件方差分析各因素對(duì)目的蛋白表達(dá)量的影響
3討論
蛋白質(zhì)藥物憑借其活性高、特異性強(qiáng)、毒性低、生物功能明確和有利于臨床應(yīng)用等特點(diǎn)，已經(jīng)成為醫(yī)藥領(lǐng)域的重要組成部分。重組蛋白可通過(guò)原核表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲表達(dá)系統(tǒng)和酵母系統(tǒng)等進(jìn)行表達(dá)。在本實(shí)驗(yàn)中，我們利用DNA重組技術(shù)構(gòu)建融合基因CSP-MDA-7/IL-24，選取具有易于培養(yǎng)、繁殖快、表達(dá)量高、成本低、易純化和遺傳載體中被誘導(dǎo)表達(dá)，蛋白產(chǎn)物以包涵體的形式存在，有利于目的蛋白的進(jìn)一步提純。
研究表明，細(xì)菌生長(zhǎng)速率對(duì)外源蛋白表達(dá)有很大影響。為提高目的蛋白表達(dá)效率，我們通過(guò)測(cè)定重組菌株的生長(zhǎng)曲線，確定最佳誘導(dǎo)時(shí)機(jī)。單因素分析確定最適培養(yǎng)基pH值、最佳誘導(dǎo)溫度、最佳誘導(dǎo)時(shí)間和最適誘導(dǎo)劑IPTG濃度，并在此基礎(chǔ)上各選取5個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，摸索出最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件。單因素分析結(jié)果表明，在最佳誘導(dǎo)時(shí)機(jī)，隨著誘導(dǎo)時(shí)間不斷增加，目的蛋白表達(dá)量也在不斷增加，誘導(dǎo)4 h時(shí)達(dá)到濃度高峰。在相同誘導(dǎo)時(shí)間下，SDS-PAGE結(jié)果分析表明，培養(yǎng)基pH為7.0、誘導(dǎo)溫度42℃、不同IPTG濃度下表達(dá)量相當(dāng)。正交試驗(yàn)SDS-PAGE結(jié)果表明，CSP-MDA-7/IL-24重組蛋白的表達(dá)最佳條件組合為誘導(dǎo)4 h、pH7.0、誘導(dǎo)溫度42℃、IPTG濃度0.12 mmol/L，此時(shí)目的蛋白表達(dá)量最高，達(dá)43.6%。正交分析結(jié)果表明，四因素五水平中，誘導(dǎo)溫度對(duì)重組蛋白表達(dá)具有顯著性影響，而pH值、溫度和IPTG濃度則無(wú)明顯影響。
本研究確定了重組蛋白肝靶向肽-抗腫瘤肽的最佳表達(dá)條件，為深入探討其復(fù)性條件、純化條件、生物學(xué)活性及藥物開發(fā)等提供了更多實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
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