1.3.4 纖維素酶的測(cè)定
1.3.4.1 接種與培養(yǎng)
將固體曲培養(yǎng)料121℃、60min蒸汽滅菌，冷卻至35℃左右,搶溫接種待測(cè)菌株懸液。置30℃靜止培養(yǎng),每24h取樣測(cè)纖維素酶活。
1.3.4.2 粗酶液的制備
稱2.0g發(fā)酵曲,加蒸餾水20 mL，30℃水浴1h，每15min搖勻一次，3000r/min離心5min，取上清液為粗酶液。
1.3.4.3 纖維素酶活的檢測(cè)
用3,5二硝基水楊酸(DNS)比色法，測(cè)定還原糖含量來確定FPA、CMC、C1三種纖維素酶活。
FPA濾紙酶活的測(cè)定：緩沖液2.0 mL,加入1× 6cm新華濾紙一張,50℃預(yù)熱5min后加入0.5 mL酶液,50℃保溫1h,取出加2.5 mLDNS試劑,煮沸5min,冷卻后加水5 mL,540nm處測(cè)定還原糖。
CMC酶活的測(cè)定（內(nèi)切葡聚糖酶）：2.0 mL含5% CMC的緩沖液,50℃預(yù)熱5min后加0.5 mL酶液,其余操作同F(xiàn)PA酶活的測(cè)定。
C1酶活測(cè)定：2.0 mL緩沖液中加入50mg脫脂棉,50℃預(yù)熱5min后加入0.5 mL酶液,50℃保溫24h,其余操作同F(xiàn)PA酶活的測(cè)定。
酶活單位U:采用國(guó)際制單位,即在上述條件下，每分鐘產(chǎn)生1μmol葡萄糖的酶量為一個(gè)單位。酶活力即扣除參比溶液中還原糖后,每毫升酶液中所含酶活單位的量。
1.3.5 菌株鑒定
參考《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》、《真菌鑒定手冊(cè)》進(jìn)行鑒定。
1.3.6 復(fù)合菌劑在糞便堆積發(fā)酵中最佳生長(zhǎng)條件的研究
以牛糞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，在實(shí)驗(yàn)室模擬條件下，將牛糞自然風(fēng)干至含水量50%以下，去除大塊雜質(zhì)，磨碎待用，按L9(34)正交設(shè)計(jì)各因素水平用稻殼粉、2%麥飯石粉、水等調(diào)節(jié)物料的C/N比以及水分、pH值后，高溫滅菌，置于中號(hào)醫(yī)用搪瓷盤中，上覆塑料薄膜保水，28℃±1℃培養(yǎng)，培養(yǎng)2d后，進(jìn)行翻堆，4d測(cè)定活菌數(shù)。每處理3次重復(fù)，均等取樣混合測(cè)定各數(shù)值。活菌數(shù)的測(cè)定參見農(nóng)業(yè)部微生物肥料標(biāo)準(zhǔn)NY884-2005進(jìn)行。正交設(shè)計(jì)各因素水平見表1。
表1 復(fù)合菌劑在堆積發(fā)酵中最佳生長(zhǎng)條件 L9(34)正交設(shè)計(jì)
2 結(jié)果與分析
2.1 纖維素分解菌菌種篩選及對(duì)濾紙、羧甲基纖維素分解能力的分析
對(duì)7種樣品進(jìn)行系統(tǒng)分離，初篩獲得約20株菌，通過對(duì)菌落形態(tài)、生長(zhǎng)速度的觀察以及分解纖維素能力判定，挑選其中3株用PDA培養(yǎng)基平板進(jìn)行分離純化得到單個(gè)菌株B1、F1、F2。單個(gè)菌株B1、F1、F2以及它們相互混合對(duì)濾紙、羧甲基纖維素分解能力見表2、表3。從表2、表3可以看出：各菌株單獨(dú)培養(yǎng)對(duì)濾紙、羧甲基纖維素均有一定的分解效果,但不如混合的效果好,B1、F1、F2混合培養(yǎng)8d時(shí)，濾紙失重率達(dá)到58.06%、酶相對(duì)活性0.93±0.00 cm·d-1，由此說明，3株菌株混合可以增加酶活力，各菌之間有很好的協(xié)同效應(yīng)。
表2 不同培養(yǎng)時(shí)間的濾紙失重率/%
表3 不同菌株的纖維素酶相對(duì)活性及對(duì)濾紙的分解效果
2.2 纖維素分解菌酶活分析
結(jié)果見表4。從表4可見：B1、F1、F2菌株在固體曲中,都能很好地生長(zhǎng),隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),酶活力提高，在培養(yǎng)5～6d時(shí),酶活力達(dá)到最高。各菌株的FPA酶活力是B1F1F2＞B1＞F1＞F2；CMC酶是F1＞B1F1F2＞B1＞F2；C1酶是B1＞B1F1F2＞F1＞F2。各菌混合后FPA酶活力顯著增加，與各菌對(duì)濾紙、羧甲基纖維素分解能力的試驗(yàn)結(jié)果相吻合，進(jìn)一步了證明菌種間的協(xié)同增效作用?；诿富盍Υ笮〉谋容^及生產(chǎn)成本的考慮，選擇B1、F1菌作為堆肥發(fā)酵的試驗(yàn)生產(chǎn)菌。
表4 不同菌株固體曲的纖維素酶活分析 單位:U/ml
2.3 菌株的鑒定
B1、F1菌株生長(zhǎng)迅速，在察氏培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)7d，直徑7～8cm，菌絲初期為白色，后期呈綠色，產(chǎn)孢叢束區(qū)擺列成同心輪紋，培養(yǎng)基背面成無色，培養(yǎng)基顏色不改變。分生孢子從菌絲的側(cè)枝上生出，直立，分枝，小枝對(duì)生，頂端不膨大，上生分生孢子團(tuán)，分生孢子球形，淺色或無色。F2菌株生長(zhǎng)迅速，在察氏培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)7d，直徑7～8cm，菌絲初期為白色，后期呈青綠色，培養(yǎng)基背面呈無色，培養(yǎng)基顏色不改變。營(yíng)養(yǎng)菌絲有隔膜，分生孢子梗從菌絲垂直生出，孢梗頂端不膨大，分枝一次，頂端為小梗，分生孢子串成不分枝的鏈狀，單個(gè)孢子球形，卵圓形，綠色。
根據(jù)各菌株的菌落特征和形態(tài)特征，按真菌分類鑒定手冊(cè)和真菌分類學(xué)進(jìn)行檢索，初步認(rèn)為B1、F1為木霉(Trichoderma),F2為青霉(Penicillium)。
2.4 復(fù)合菌劑在糞便堆積發(fā)酵中最佳生長(zhǎng)條件的研究
以牛糞為研究對(duì)象，在實(shí)驗(yàn)室模擬條件下，采用L9(34)正交設(shè)計(jì)，研究物料水分、C/N、起始pH及接種量對(duì)復(fù)合微生物菌株生長(zhǎng)的影響，結(jié)果見表5、表6。
表5 沼渣堆積發(fā)酵工藝條件的確定
表6 沼渣堆積發(fā)酵工藝條件正交試驗(yàn)方差分析（完全隨機(jī)模型）
從表5、表6可以看出,對(duì)微生物生長(zhǎng)的影響各因素按極差大小主次順序?yàn)?B＞A＞D＞C，表明物料的C/N的比例對(duì)復(fù)合菌劑活菌數(shù)（生長(zhǎng)）影響最大，物料pH影響最小。FB=38.29743＞F0.05=19,達(dá)顯著水平，表明B因素影響顯著，所以對(duì)該因素應(yīng)控制在最優(yōu)水平上,A、D、C因素對(duì)復(fù)合菌劑活菌數(shù)（生長(zhǎng)）對(duì)結(jié)果影響不大。綜合以上分析，得到最佳堆積發(fā)酵工藝條件A2B3C1D2，即物料C/N為35、水分60%、接種量5%、pH=8.0。在此工藝條件下，適合菌劑中的微生物 生 長(zhǎng) 繁 殖 ，活 菌 數(shù) 達(dá) 到 40.12×108cfu/g。
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