正丙醇是高級醇之一，是白酒中重要的風味物質(zhì)之一。中國白酒有12種風味類型，不同風味類型中正丙醇的含量差異很大。例如正丙醇是中國名牌白酒的重要風味物質(zhì)之一，如斯特酒（特味型）、茅臺酒（茅臺味型）、白云邊酒（混合型）。適量的正丙醇對白酒特殊香味的改善有一定的貢獻。但正丙醇含量高，嚴重影響白酒的口感和風味，刺激人體黏膜，危害人體健康。白酒釀造過程中產(chǎn)生正丙醇的微生物存在爭議，大多數(shù)研究人員堅持認為釀酒酵母是正丙醇的主要生產(chǎn)者。釀酒酵母中的正丙醇是通過2-酮丁酸脫羧產(chǎn)生的。作為正丙醇的前體，2-酮丁酸的代謝與正丙醇的收率密切相關。近年來，關于在釀酒酵母中合成正丙醇存在不同意見。釀酒酵母中正丙醇合成的關鍵基因和代謝途徑尚不清楚。在本文中，研究人員關注了蘇氨酸、L-高絲氨酸和丙酮酸途徑以及將2-酮丁酸轉化為正丙醇以在釀酒酵母中合成正丙醇的途徑。共選取21個與正丙醇代謝密切相關的基因，研究其對正丙醇合成的影響。通過測定每個重組菌株中21個基因的表達量以及突變菌株中L-天冬氨酸、蘇氨酸、甘氨酸、2-酮丁酸、丙酮酸、丙醛和正丁酸的含量，分析基因對正丙醇代謝的調(diào)控作用。通過使用Bioscreen全自動生長曲線分析儀對釀酒酵母的生長和發(fā)酵曲線的監(jiān)測，研究了正丙醇代謝相關基因缺失對突變菌株生長和發(fā)酵性能的影響。同時也測定了每個重組酵母菌株產(chǎn)生的異丁醇、異戊醇和2-苯乙醇的量。
Bioscreen全自動生長曲線分析儀的應用
將酵母菌株接種到YEPD液體培養(yǎng)基(5 mL)中，并在30°C搖床培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。然后將40μL酵母細胞液加入360μL YEPD培養(yǎng)基中，并將混合物轉移至96孔板中。通過Bioscreen自動生長曲線分析系統(tǒng)（OY Growth Curves Ab Ltd.，Helsinki，F(xiàn)inland）每30分鐘測量600 nm處的光密度（OD 600）。
實驗結果
刪除正丙醇代謝相關基因以評估在正丙醇合成中的作用，以確定釀酒酵母生產(chǎn)正丙醇的關鍵基因和途徑。研究結果表明CYS 3、GLY 1、ALD 6、PDC 1、ADH 5和YML 082 W是影響酵母中正丙醇代謝的關鍵基因。n _與α5相比，α5ΔGLY 1、α5ΔCYS 3和α5ΔALD 6的丙醇濃度分別增加了121.75、22.75和17.78%。與α5相比，α5ΔPDC 1、α5ΔADH 5和α5ΔYML 082 W的正丙醇含量分別降低了24.98%、8.35%和8.44%。測定中間代謝物的含量，結果表明蘇氨酸途徑中甘氨酸和蘇氨酸的相互轉化和2-酮丁酸生成丙醛是正丙醇生成的核心途徑。此外，YML 082 W通過L-高絲氨酸直接生產(chǎn)2-酮丁酸，在正丙醇的合成中發(fā)揮了重要作用。
圖1、釀酒酵母中正丙醇的代謝途徑。圖中的三個色塊顯示了釀酒酵母中與正丙醇代謝相關的三個途徑，分別是L-高絲氨酸、蘇氨酸和丙酮酸途徑。小橢圓形圓圈中的基因分別被刪除。
圖2、每個重組菌株和親本菌株α5中的正丙醇含量。發(fā)酵后測定各重組菌株的正丙醇產(chǎn)量，研究代謝途徑基因敲除對酵母菌生產(chǎn)正丙醇的影響。結果表明，除α5ΔTHR 1、α5ΔTHR 4和α5ΔTHR 6外，所有重組菌株均能順利發(fā)酵。
圖3、突變體和α5基因表達水平的測定。每行代表與親本菌株α5相比，每個重組菌株中每個靶基因的表達水平。紅色和綠色表示與對照相比，靶基因的表達水平分別上調(diào)和下調(diào)。深色表示大幅上調(diào)或下調(diào)。與α5相比，最大上調(diào)和下調(diào)倍數(shù)分別為21.731和1.18064×10–6。
圖4、重組菌株和親本菌株α5的生長和發(fā)酵特性。(A)重組菌株和α5的生長曲線。(B)各重組菌株和α5的CO2排放量。(C)每個重組菌株和α5的酒精含量。誤差條代表三個重復發(fā)酵實驗數(shù)據(jù)的標準偏差。Bioscreen全生長曲線分析儀用于測定親本菌株α5和各突變株在YEPD液體培養(yǎng)基中的生長曲線，研究正丙醇代謝途徑中正丙醇代謝相關基因缺失對酵母菌生長的影響。從生長曲線的整體趨勢來看，突變體的生長趨勢與α5基本相同。除了處于穩(wěn)定期的α5ΔALD 4和α5ΔALD 5外，在突變體之間沒有觀察到細胞密度的明顯差異。這表明正丙醇代謝途徑相關基因的缺失對釀酒酵母的生長性能沒有不利影響。
圖5、重組菌株和親本菌株α5的高級醇的形成。(A)各重組菌株中異丁醇和α5的含量。(B)各重組菌株和α5中異戊醇的含量。(C)各重組菌株中2-苯乙醇的含量和α5。誤差條代表三個重復發(fā)酵實驗數(shù)據(jù)的標準偏差。
總結
釀酒酵母生產(chǎn)的正丙醇對中國白酒的口感和風味有顯著影響。刪除正丙醇代謝相關基因以評估在正丙醇合成中的作用，以確定釀酒酵母生產(chǎn)正丙醇的關鍵基因和途徑。結果表明CYS 3、GLY 1、ALD 6、PDC 1、ADH 5和YML082W是影響酵母中正丙醇代謝的關鍵基因。與α5相比，α5ΔGLY 1、α5ΔCYS 3和α5ΔALD 6的丙醇濃度分別增加了121.75、22.75和17.78%。與α5相比，α5ΔPDC 1、α5ΔADH 5和α5ΔYML 082 W的正丙醇含量分別降低了24.98%、8.35%和8.44%。測定中間代謝物的含量，研究結果表明蘇氨酸途徑中甘氨酸和蘇氨酸的相互轉化和2-酮丁酸生成丙醛是正丙醇生成的核心途徑。此外，YML 082 W通過L-高絲氨酸直接生產(chǎn)2-酮丁酸，在正丙醇的合成中發(fā)揮了重要作用。該研究為釀酒酵母中正丙醇的合成提供了有價值的見解，并為未來白酒釀造中酵母菌株的優(yōu)化提供了理論基礎。
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