土壤理化性質(zhì)分析
土壤含水量的測定方法是將10 g土壤在105℃下烘干。使用pH計測定每個樣本的pH值，土壤與去離子水的混合比例為1:2.5。土壤總有機碳含量使用自動元素分析儀（Vario TOC cube,Elementar,Germany）測定。土壤總氮含量使用自動凱氏定氮儀測定（NA1500，F(xiàn)isons Instruments,Milano,Italy）。土壤總磷含量采用鉬銻比色法測定。土壤總鉀含量使用火焰光度法測定。土壤中的銨態(tài)氮和硝態(tài)氮濃度使用2 M KCl溶液浸提，土壤與溶液的比例為1:5。隨后，分別使用靛酚藍法和氯化釩分光光度法測定KCl提取液中的銨態(tài)氮和硝態(tài)氮濃度。堿性和酸性土壤中的有效磷含量分別采用Olsen法和Bray法測定。土壤質(zhì)地使用激光粒度分析儀（LS-909,OMEC Instruments Co.,Ltd）測定。根據(jù)先前研究提出的標準，土壤顆粒分為黏粒（0~2μm）、粉粒（2~50μm）和砂粒（50~2000μm）。
土壤核酸提取
使用DNeasy PowerSoil Pro試劑盒（Qiagen,Hilden,Germany）從0.50 g鮮土中提取總DNA。此外，分別使用堿性緩沖液洗滌、DNA酶消化和PMA處理提取土壤胞內(nèi)DNA。除DNA外，使用RNeasy PowerSoil Total RNA試劑盒（Qiagen,Hilden,Germany）提取總RNA。我們使用總DNA作為參考，評估不同方法對土壤胞外和胞內(nèi)DNA多樣性分析的影響。堿性緩沖液洗滌方法按照已有方法進行。簡而言之，將500μL PBS緩沖液（0.12 M；pH 7.4）和0.50 g新鮮土壤加入微量離心管中，水平搖動30 min（100 rpm）。隨后，將懸濁液在7500×g下離心30 min（4℃），棄上清。重復此過程兩次后，使用DNeasy Power Soil Pro試劑盒提取殘留土壤中的胞內(nèi)DNA。PMA處理按照已有的方法進行，并稍作修改。PMA染料的濃度和處理時間基于先前研究優(yōu)化，以確保有效去除胞外DNA。
具體而言，PMA溶解在二甲基亞砜（DMSO）中，溶劑體積為500μL，最終PMA濃度為40μM。將該溶液加入0.50 g新鮮土壤中，混合物在室溫下避光孵育5 min，并輕輕旋轉。隨后，將試管水平放置在冰盒上，并使用懸掛的650 W鹵素燈在距離試管20 cm處進行四次連續(xù)的光暗循環(huán)，每次30 s。此后，將試管在10,000×g下離心2 min，棄上清。最后，使用DNeasy Power Soil Pro試劑盒從殘留土壤中提取胞內(nèi)DNA。DNase預消化法按照最近研究的描述進行。反應混合物包括80μL DNase I（Sigma-Aldrich,St.Louis,Missouri,USA）、805μL無核酸酶水、10μL MgCl2（1 M）、5μL牛血清白蛋白（10 mg/mL）、100μL Tris-HCl（0.5 M；pH=7.5）和0.50 g新鮮土壤。將試管在37℃下水平孵育60 min，搖動速度為100 rpm。隨后，向每管加入50μL 0.5 M EDTA，并在75°C下孵育10 min以終止DNase反應。之后，將試管在12,000×g下離心20 min，棄去上清液。最后，使用DNeasy Power Soil Pro試劑盒提取殘留土壤中的胞內(nèi)DNA。使用RNeasy Power Soil Total RNA試劑盒從2.0 g冷凍土壤中提取RNA，通過加入1μL DNase I（Qiagen,Hilden,Germany,10 U）、10μL 10×DNase Buffer去除90μL RNA提取物中的DNA殘留。反應在37°C下孵育30 min以確保有效去除DNA。隨后以總RNA作為模板，使用PrimeScript?II 1st Strand cDNA Synthesis Kit（Takara BioInc.,Shiga,Japan）合成cDNA。反應體系包括16μL模板RNA、2μL dNTP Mixture（10 mM）和2μL隨機六聚體（50μM）。在65°C下孵育5 min后，迅速冷卻至冰上。隨后，向反應體系中加入8μL 5×PrimeScript II Buffer、1μL RNase Inhibitor（40 U/μL）、2μL PrimeScript I RTase（200 U/μL）和9μL無RNase水。最后，反應體系在30°C下孵育10 min，隨后在42°C下孵育60 min，并在95°C下終止5 min。
qPCR和高通量測序
為定量原核生物16S rRNA基因拷貝數(shù)，我們使用LightCycler96實時PCR系統(tǒng)（Roche,Germany），使用的通用引物為515F（5′-GTG NCA GCM GCC GCG GTA A-3′）和806R（5′-GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT-3′）。在進行高通量測序時，使用相同的通用引物擴增16S rRNA基因。在土壤微生物群落分析中，最低序列數(shù)為50,000，而在模擬群落實驗中，測序深度為35,000。所有詳細的PCR條件和生物信息學分析程序見補充材料的方法部分。
土壤原核生物共現(xiàn)模式分析
原核生物共現(xiàn)網(wǎng)絡分析僅包括出現(xiàn)頻率高于50%（至少在一半樣本中出現(xiàn)）且平均相對多度大于0.01%的ASV。選擇此閾值是為了將分析重點放在采樣中代表性較好的微生物類群上。使用R包WGCNA構建Spearman相關性矩陣，相關系數(shù)閾值為0.80，F(xiàn)DR調(diào)整后的p值<0.05，以保留共現(xiàn)網(wǎng)絡分析中微生物類群之間的強相關性。使用“igraph”包計算網(wǎng)絡屬性，并使用Gephi進行可視化。通過計算自然連通性在移除不同比例節(jié)點時的變化來評估網(wǎng)絡的魯棒性。網(wǎng)絡分析方法的詳細描述，包括節(jié)點分類和生態(tài)學解釋，見補充方法。土壤原核生物群落構建機制分析在本研究中，我們分別使用中性群落模型（NCM）、修正隨機性比率（MST）和iCAMP模型來量化基于不同方法的土壤群落構建機制。更多方法細節(jié)見補充材料方法部分。
基于不同方法的土壤活體原核生物多度和多樣性分析準確性評估
從上述52個土壤樣本中選擇了8個典型土壤，評估不同方法對土壤活體原核生物多度和多樣性分析的準確性（圖S14b）。這些土壤通過在121℃下高壓滅菌30 min，隨后在室溫下孵育24 h進行滅菌。此過程重復三次以確保徹底滅菌。我們構建了一個由大腸桿菌Escherichia coli（革蘭氏陰性，快速生長）、熒光假單胞菌Pseudomonas fluorescens（革蘭氏陰性，多功能）、脫氮副球菌Paracoccus denitrificans（革蘭氏陰性，反硝化）、枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis（革蘭氏陽性，產(chǎn)孢子）和吸水鏈霉菌Paracoccus denitrificans（革蘭氏陽性，絲狀）組成的模擬群落，所有菌株均購自BNCC（BeNa Culture Collection）。這些菌株的詳細信息見表S7。將模擬群落接種到每份滅菌土壤中，并立即提取總DNA、胞內(nèi)DNA和RNA，具體操作如補充方法所述。我們使用總DNA作為活體原核生物群落的參考，因為模擬群落由活菌組成。滅菌土壤中可忽略的胞外DNA進一步支持總DNA作為活體原核生物群落的可靠標記。
隨后，進行qPCR和高通量測序，以分別測定土壤原核生物的多度和多樣性，具體如補充方法所述。鑒于接種菌株的序列在所有研究地點中占96%以上，我們隨后的分析僅關注這5個菌株。
基于不同方法的土壤細胞外DNA去除效率測定
本研究選擇了一份草地土壤和一份森林土壤，進一步評估了不同方法對土壤胞外DNA的去除效率（圖S14c）。使用帶標簽引物的的16S rDNA模擬胞外DNA。簡而言之，在標簽引物在515F的5′端添加了19bp的人肌動蛋白序列（5′-CAT TGG CAA TGA GCG GTT C-3′）。以從土壤樣本中提取的DNA為模板，使用ACTF-515F和806R生成ACTF標記的16S rDNA PCR產(chǎn)物。PCR體系和參數(shù)如補充方法中的描述相同。使用GeneJET凝膠提取試劑盒（Thermo Scientific,Lithuania）純化PCR產(chǎn)物，并使用Nanodrop2000（NanoDrop Technologies,USA）定量。隨后，將ACTF標記的16S rDNA擴增子（源自每個土壤樣本）以相當于該土壤總DNA含量50%的濃度添加到相應土壤中。
立即提取總DNA和胞內(nèi)DNA，如前所述，每個樣本四個重復。然后使用ACTF和806R通過qPCR測定DNA提取物中的ACTF-16S rDNA拷貝數(shù)。在原始土壤所提取的DNA中，基于ACTF和806R未觀察到陽性擴增，這很大程度上確保了該方法的可靠性。最終，DNA去除效率計算為胞內(nèi)DNA中ACTF標記的16S rDNA拷貝數(shù)與總DNA中ACTF標記的16S rDNA拷貝數(shù)的比值。在本部分實驗中，同樣選擇總DNA作為參考，因為它可以提取添加到土壤中的所有被標記的胞外DNA，為比較不同方法去除胞外DNA的有效性提供了基準。
統(tǒng)計分析
本研究使用重復測量方差分析（RMANOVA）確定不同研究方法對土壤原核生物多度和多樣性分析的影響。
使用Venn Diagram和UpSet R包識別和可視化了不同核酸提取方法表征的原核生物群落在ASV水平上共有和特有的ASV數(shù)量。使用非度量多維標度（NMDS）、主坐標分析（PCoA）和置換多元方差分析（PERMANOVA）評估了不同研究方法對土壤原核生物群落結構的影響。使用Wilcoxon符號秩和檢驗確定不同活體原核生物研究方法對原核生物類群相對多度的影響，并使用Graphlan（http://gephi.github.io/）進一步可視化。類似方法也用于評估不同方法下活體和總體原核生物群落結構的差異。此外，計算了配對Bray-Curtis距離以進行進一步分析。使用geosphere包中的“distm”函數(shù)計算每對采樣點之間的地理距離，然后基于Mantel檢驗分析了地理距離與群落組成相似性之間的關系。使用Mantel檢驗計算環(huán)境因素與原核生物群落結構之間的關系。使用結構方程模型探索環(huán)境因素與微生物群落之間的潛在因果關系。方法細節(jié)見補充材料方法部分。大多數(shù)統(tǒng)計分析在R（4.3.2）中進行。
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