摘要:里約熱內(nèi)盧大都會區(qū)是貓相關孢子絲菌病的高度流行區(qū)。本研究旨在評估一例慢性、破壞性播散性孢子絲菌病患者體內(nèi)連續(xù)分離的孢子絲菌分離株的毒力。在五年期間，從皮膚滲出物和骨骼樣本中培養(yǎng)了五株孢子絲菌分離株，經(jīng)分子鑒定均為巴西利亞孢子絲菌。與大蠟螟幼蟲中的早期分離株相比，最終的分離株表現(xiàn)出顯著更高的毒力。我們得出結論，巴西利亞孢子絲菌具有在體內(nèi)增強毒力的能力。這一發(fā)現(xiàn)對于護理巴西利亞孢子絲菌病患者的臨床醫(yī)生具有重要意義，并表明需要進一步研究以確定慢性疾病期間致病性增強的潛在機制。
引言
孢子絲菌病是一種由孢子絲菌復合體引起的皮下真菌病。分子研究已鑒定出巴西利亞孢子絲菌、球形孢子絲菌、盧里孢子絲菌、墨西哥孢子絲菌、淺白孢子絲菌和申克孢子絲菌（全球最常見的物種）是不同地區(qū)孢子絲菌病的病原體。
里約熱內(nèi)盧大都會區(qū)是貓相關孢子絲菌病的高度流行區(qū)，主要病原體是巴西利亞孢子絲菌。巴西利亞孢子絲菌患者表現(xiàn)為急性、慢性、固定型、淋巴管型、黏膜型、播散型和復發(fā)性孢子絲菌病，以及超敏反應表現(xiàn)。在非免疫抑制患者中播散性病例比其他地區(qū)和其他物種先前報道的更常見，這可能與受感染貓的多次深度抓傷導致組織中的高接種量有關，也與巴西利亞孢子絲菌相對于其他孢子絲菌物種具有更強的毒力有關。
除了接種量之外，促進巴西利亞孢子絲菌導致頻繁和嚴重疾病的候選因素包括耐熱性、酶和其他分子的產(chǎn)生、對氧化應激和抗真菌藥物的耐藥性。目前，關于巴西利亞孢子絲菌毒力的信息有限。本研究的目的是描述從一例慢性、破壞性播散性孢子絲菌病患者體內(nèi)連續(xù)分離的孢子絲菌分離株毒力增強的演變過程。
病例報告
一名61歲的退休砌磚工，患有糖尿病和高血壓，因6年皮膚病變病史被轉診至里約熱內(nèi)盧Evandro Chagas國家傳染病研究所傳染病皮膚病學實驗室。初步診斷后，他接受了5個月的碘化鉀治療，皮膚病變愈合。然而，他主訴膝蓋和左腕關節(jié)疼痛逐漸加重，至轉診至INI前兩年需坐輪椅。轉診至INI前6個月，他注意到皮膚病變復發(fā)。
在我們初次檢查時，患者四肢有多處疤痕，左腕背側有一個滲出性小潰瘍病變和一個囊性病變（圖1A-B）。雙膝和左腕關節(jié)強直。X光片顯示這些關節(jié)處有溶骨性病變和硬化（圖1C-D）。人類免疫缺陷病毒和人類T淋巴細胞病毒檢測為陰性。總淋巴細胞計數(shù)為1,470/μL，T CD4+計數(shù)為554/μL，均正常。初始T細胞數(shù)量相當?shù)停?4/μL）。從左腕部皮膚病變培養(yǎng)出孢子絲菌屬，通過酶聯(lián)免疫吸附測定法進行的孢子絲菌病抗體檢測為陽性（OD:2.548/Cut-Off:0.605）。
由于他常規(guī)藥物（卡托普利、氫氯噻嗪和格列本脲）與伊曲康唑存在潛在有害相互作用，他接受了特比萘芬500 mg/天治療32個月，直至皮膚病變愈合且影像學模式穩(wěn)定。然而，由于11個月后皮膚病變復發(fā)，特比萘芬重新開始使用，并且由于疾病的頑固、復發(fā)性質，他目前繼續(xù)接受這種抗真菌治療。由于雙膝和左腕嚴重、永久性畸形（經(jīng)磁共振證實），他仍需坐輪椅。在他的病程中，從左前臂和左膝采集了皮膚樣本，以及從左股骨采集了活檢樣本。
材料與方法
倫理聲明
INI/Fiocruz,RJ,Brazil的研究倫理委員會根據(jù)協(xié)議編號0024.0.009.000-10批準了本研究。
臨床標本
在5年期間從患者的病變處采集了五份生物標本。前3份樣本（IPEC32742,IPEC33070和IPEC33718，下文分別稱為"1"、"2"和"3"）于2007年9月至2008年3月期間通過細針無菌穿刺從左腕部囊性病變采集；第四份樣本（IPEC33946，隨后稱為"4"）來自2008年4月的左股骨活檢；第五份樣本（IPEC43174，下文稱為"5"）來自2012年2月左膝上皮膚的潰瘍性結節(jié)。分離株儲存在-20°C冰箱中含有10%脫脂奶的凍存管中。
孢子絲菌病診斷
所有臨床標本均進行常規(guī)真菌學檢查，包括10%KOH濕片直接鏡檢和在2%沙氏葡萄糖瓊脂和Mycobiotic瓊脂上培養(yǎng)。培養(yǎng)物在25°C下孵育，觀察4周是否有真菌生長。通過在37°C的腦心浸液瓊脂上培養(yǎng)7天轉化為酵母樣形式來證明雙相性。
分子鑒定
使用氯仿/異戊醇方法從分離株的酵母相提取基因組DNA，用于部分β-微管蛋白和幾丁質合成酶編碼基因的測序，以及如所述進行T3B PCR指紋圖譜分析。在T3B PCR指紋圖譜中，對照菌株為巴西利亞孢子絲菌(CBS120339)、墨西哥孢子絲菌(MUM11.02)、申克孢子絲菌(ATCC32286)和球形孢子絲菌(IPEC27135)。在測序分析中，使用巴西利亞孢子絲菌(CBS120339)、球形孢子絲菌(FMR8600)、墨西哥孢子絲菌(CBS120341)、淺白孢子絲菌(CBS111110)和申克孢子絲菌(FMR8604)作為NCBI公共Genbank的參考菌株。
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