1.3 改性葡聚糖包埋乳酸乳球菌體系的構(gòu)建
參考本課題組以往方法并加以改進。LL 接種于8 mL MRS 液體培養(yǎng)基中，并置于37 ℃的恒溫培養(yǎng)振蕩器中培養(yǎng)過夜。培養(yǎng)結(jié)束后離心（6 000 r/min，4 min）獲得菌泥，并用PBS 緩沖液洗滌菌泥2 次。隨后將菌泥重懸于1 mL PBS 緩沖液中，備用。將100 μL 菌懸液（活菌數(shù)約為1×108 CFU/mL）、10 μL TA 溶液（40 mg/mL）和10 μL FeCl3 溶液（10 mg/mL）分別加入880 μL PBS 緩沖液中，渦旋60 s，使其在LL 表面形成牢固的金屬-酚醛網(wǎng)絡(luò)（Fe-TA）結(jié)構(gòu)，獲得LL@Fe-TA 體系。用PBS 緩沖液洗滌該體系2 次，以除去未反應(yīng)的TA和Fe3+。將LL@Fe-TA 體系重懸于990 μL 的PBS緩沖液中，隨后加入10 μL 不同質(zhì)量濃度的mGN，使得mGN 在體系中最終質(zhì)量濃度為0～0.2 mg/mL，并獲得羧甲基化β-葡聚糖包埋乳酸乳球菌體系LL@Fe-TA@mGN。最后用PBS 緩沖液洗滌2 次，以除去體系中多余的mGN。
1.4 LL@Fe-TA@mGN 的粒徑與電位分析
取1 mL 新鮮制備的LL@Fe-TA@mGN 稀釋于9 mL 去離子水中，輕輕渦旋，使其充分分散于離心管中，使用激光粒度分析儀對LL@Fe-TA@mGN 的粒徑與電位進行測定。
1.5 LL@Fe-TA@mGN 的生長曲線測定
將LL@Fe-TA@mGN 按照2%（體積分數(shù)）的接種量接種于新鮮的MRS 液體培養(yǎng)基中。將該體系置于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中，輕輕搖晃，以未接種的MRS 液體培養(yǎng)基作為空白組，未包埋的LL作為對照組。培養(yǎng)0，2，4，6，8，10，12 h 后，使用酶標(biāo)儀測定菌株在波長600 nm 處的OD 值。
1.6 LL@Fe-TA@mGN 的微觀形態(tài)分析
根據(jù)Feng等的方法，使用SEM 觀察LL@Fe-TA@mGN 的表面形態(tài)。將MRS 液體培養(yǎng)基中的菌體樣本離心（6 000 r/min，4 min）并去除上清液，用PBS 緩沖液洗滌3 次。隨后將沉淀用2.5%的戊二醛溶液固定3 h。緊接著被固定的樣本用PBS 緩沖液洗滌3 次，再用清水洗滌2 次。用體積分數(shù)30%，50%，70%，80%，90%的乙醇溶液連續(xù)對樣本進行脫水，每次脫水15～20 min。之后用100%的乙醇溶液脫水2 遍，每次脫水15～20 min。使用干燥箱在40 ℃下對樣品進行干燥10～15 min，隨后進行噴金并上樣觀察。將1 滴細菌懸浮液小心地沉積在Formvar/carbon 200 目網(wǎng)格上并在空氣中干燥，隨后進行TEM 觀察。
1.7 LL@Fe-TA@mGN 的胃液與膽鹽耐受性研究
將等量LL 和LL@Fe-TA@mGN（1×109 CFU/mL）分別轉(zhuǎn)移到1.6 mL 新鮮的模擬胃液中（Simulated gastric fluid，SGF；pH 2.5，1 000 mL 蒸餾水，5 g 胃蛋白酶，8.5 g NaCl）和4%膽汁鹽中。然后，在37 ℃，200 r/min 的搖床條件下孵育。在預(yù)定時間點（0，1，2 h）取300 μL 反應(yīng)溶液，離心（6 000 r/min，4 min）得到沉淀，并用PBS 緩沖液洗滌2 次。在連續(xù)稀釋后，將獲得的細菌懸液涂布在固體MRS 平板上。37 ℃孵育24 h 后，進行菌落計數(shù)。
1.8 LL@Fe-TA@mGN 的體內(nèi)滯留成像
將10 只C57BL/6J 小鼠（禁食12 h）分為2組，分別口服Cy5 標(biāo)記的LL@Fe-TA@mGN 和LL（1×109 CFU/mL）。使用活體成像系統(tǒng)在小鼠口服給藥后預(yù)定時間點（4 h，8 h）獲取小鼠活體胃腸道圖像。
1.9 數(shù)據(jù)處理與分析
采用GraphPad Prism 8 進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。統(tǒng)計學(xué)顯著性分析采用單因素方差分析（ANOVA）。*：P ＜0.05；**：P ＜0.01；***：P ＜0.001；****：P ＜0.0001。
2 結(jié)果與分析
2.1 LL@Fe-TA@mGN 的粒徑與電位
粒徑與電位分析是驗證益生菌包埋是否成功的重要手段。當(dāng)使用具有不同電勢的壁材包埋益生菌時，所得益生菌包埋體系的整體帶電情況會發(fā)生相應(yīng)改變。Anselmo等利用層層自組裝的方法對芽孢乳酸菌進行包埋，未包埋的益生菌帶有負電，包裹上一層殼聚糖后，體系變成正電，隨后在最外層包裹上帶負電的海藻酸鈉，使體系的整體電勢變成負電。Liu等也通過粒徑與電位的變化來說明益生菌的包埋情況。本研究中，通過LL@Fe-TA@mGN 的粒徑與電位分析，確定了LL的包埋情況與最外層mGN 的最佳使用劑量。如圖1 和圖2 所示，相對于未包埋的LL，LL@Fe-TA@mGN 的粒徑與電位都有顯著變化，說明mGN被金屬-酚醛網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)（Fe-TA）吸附在LL 的表面。當(dāng)包埋LL 的mGN 質(zhì)量濃度為0.12 mg/mL時，LL@Fe-TA@mGN 的粒徑和zeta-電位都達到峰值，表明在該質(zhì)量濃度下，單個LL 被mGN 完全包裹。
圖1 包埋過程中使用的mGN 質(zhì)量濃度（0～0.2 mg/mL）對LL@Fe-TA@mGN 粒徑的影響
注：*.P ＜0.05；**.P ＜0.01。
圖2 包埋過程中mGN 質(zhì)量濃度（0～0.2 mg/mL）對LL@Fe-TA@mGN zeta-電位的影響
注：*.P ＜0.05。
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